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广州管圆线虫病，亦称嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原体广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)幼虫侵害人的中枢神经系统而引起。广州管圆线虫病的确诊主要靠从病人脑脊液中查到虫体，但检获率很低，约为10％。通常该病的诊断需依靠临床症状、流行病学资料和免疫诊断。由于虫体抗原获得比较困难，为了更方便获得特异性诊断抗原，本研究根据构建的广州管圆线虫五期幼虫cDNA文库的免疫筛选结果，选择文库中表达的具有免疫反应性并且同源性最高的Acll基因，并进行生物信息学分析，PCR扩增后克隆入pET28a(+)载体中，进行诱导表达及免疫学鉴定。
目的：
1对前期用免疫探针筛选获得的广州管圆线虫五期幼虫特异性抗原Acll基因进行T-A克隆及测序，利用生物信息学方法分析其结构和功能，从而为下一步表达载体的构建提供基因材料。
2通过构建含广州管圆线虫五期幼虫特异性抗原Acll基因的原核表达载体，获得广州管圆线虫五期幼虫特异性抗原Acll的融合蛋白，并对其进行免疫学鉴定，从而为广州管圆线虫病的免疫诊断研究奠定基础。
方法：
1广州管圆线虫五期幼虫Acll基因的克隆及特性分析
1.1T-A克隆后测序鉴定，BLAST同源性分析，并对其物理化学性质进行预测。
2广州管圆线虫五期幼虫Acll基因原核表达系统的构建
2.1EcoRI和XhoI双酶切重组p30的T载体。
2.2将Acll基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体后转入E.coliBL21(DE3)宿主菌中。
2.3用诱导剂IPTG对重组蛋白Acll进行诱导表达。
3重组Acll融合蛋白的纯化及鉴定
3.1使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pET-28a(+)-Acll表达产生的重组蛋白，SDS-PAGE鉴定其纯度。
3.2对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度法测定其浓度。
3.3Westernblotting鉴定重组蛋白Acll的免疫学特性。
3.4ELISA法检测感染广州管圆线虫五期幼虫的小鼠血清。
结果：
1PCR扩增得到特异的广州管圆线虫五期幼虫Acll基因，生物信息学分析得到广州管圆线虫五期幼虫Acll基因序列与犬钩虫和秀丽隐杆线虫一种推测的亚硫酸盐氧化酶序列同源性为78％。与原鸡的亚硫酸盐氧化酶的氨基酸序列同源性为98％。
2成功构建广州管圆线虫五期幼虫Acll基因的原核表达系统，目的基因在克隆载体和表达载体中的测序结果完全相同。
3表达产物主要存在于包涵体中，其相对分子质量约为30kD，纯化后的重组蛋白能被感染广州管圆线虫五期幼虫的小鼠血清特异性识别，提示重组蛋白Acll具有良好的免疫反应性。ELISA法检测小样本感染广州管圆线虫五期幼虫的小鼠血清阳性率为100％。
结论：
本实验成功构建含广州管圆线虫五期幼虫Acll基因的原核表达载体pET28(+)-Acll，IPTG诱导表达出与理论大小相一致的重组蛋白，经Ni-NTA亲和层析法纯化，制备出高纯度的融合蛋白，Westernblotting鉴定及ELISA检测后，表明重组蛋白表现出良好的免疫反应性。该实验为广州管圆线虫病的免疫诊断奠定了基础。