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[目的]构建Egr-1启动子调控的含TNF-α和HSV1-TK双目的基因的重组质粒载体,将其转染至人脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1中,给予2Gy的125I照射后,检测TNF-α和HSV1-TK在细胞中的表达量,探讨辐射对重组质粒表达的影响,为体外及体内实验探求杀肿瘤细胞的有效性及可行性提供实验依据和材料。
[方法]从GenBank公布的序列中查找人源性的Egr-1启动子序列、人源性TNF-α序列以及HSV1-TK的序列,通过化学合成法合成这三段目的基因；经酶切、连接及PCR反应构建pEgr-1-TNFα、pEgr-1—TK及pEgrl—TNF-TK重组质粒,并对其进行测序；序列正确的重组质粒转化至感受态大肠杆菌DH5α中备用。通过选择性培养基对含重组质粒的大肠杆菌进行扩增。用碱裂解-中和法对扩增好的质粒进行小提,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为正确条带后进行质粒大提以备用。用纳米粒子转染试剂盒对培养至生长对数期的OCM-1细胞进行重组质粒的转染,转染后24小时进行125I敷贴器的照射,使总剂量达到2Gy,在照射后0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取样,对样本中的TNF-α和HSV1-TK用Elisa进行检测。实验数据以平均值±标准差(x±s)表示,统计学处理采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。将转染目的质粒的OCM-1细胞分成2Gy照射组和未照射组,采用Western免疫印迹法半定量检测目的蛋白的表达。
[结果]通过限制性内切酶反应结合琼脂糖凝胶电泳鉴定以及基因序列测定证实本课题成功构建了双基因共表达质粒pEgrl-TNF-TK,在人脉络膜黑色素瘤细胞(OCM-1)转染该质粒后,运用Elisa在蛋白质水平均检测到目的基因的表达产物,较对照组有差异,TNF-α表达量的组间差异较HSV1-TK表达量的组间差异明显。其中经2Gy125I粒子辐照过的细胞表达产物显著增加(P<0.01),但双基因质粒的产物表达量与单基因质粒的产物表达量间无明显差异。Western免疫印迹法证明2Gy照射组的OCM-1细胞表达TNF-α和HSV1-TK蛋白较未照射组有所增强。
[结论]本研究成功构建pEgrl-TNF-TK重组质粒,并将其转染至靶细胞(OCM-1)中,经小剂量(2Gy)放射性粒子照射后基因表达产物显著增加,可以为下一步探讨此重组质粒联合125I粒子照射在体外、体内的抑瘤效应提供实验依据及材料。