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研究背景和目的：
早在20世纪70年代，就有学者开始关注环磷酰胺(Cyclophosphamide，CPA)的性腺毒性。半个世纪以来，有关环磷酰胺诱导卵巢损伤的主要研究结果为：(1)形态学表现为原始卵泡的减少甚至缺失；(2)环磷酰胺的主要作用靶点为窦卵泡和窦前卵泡的颗粒细胞；(3) 研究一直未能阐明环磷酰胺诱导原始卵泡丢失的机制。抗苗勒氏管激素，也称苗勒氏管抑制因子(anti Müllerjan hormone AMH，also as Müllerian Inhibitance Substance MIS)是1947年发现的一种多肽，属于TGF-β超家族；在卵巢组织，AMH主要表达于小生长卵泡和早期窦卵泡，其主要生物学作用为抑制原始卵泡的募集。鉴于环磷酰胺作用于卵巢的主要靶点是窦卵泡和窦前卵泡，而原始卵泡却因某种未知机制发生大量丢失；假定表达于生长卵泡却作用于原始卵泡的AMH在环磷酰胺诱导卵巢损伤的过程中可能发挥了作用。因此，本实验的第一个研究目的是，检测环磷酰胺作用下大鼠卵巢AMH的表达，初步探讨AMH在环磷酰胺诱导大鼠原始卵泡丢失过程中的可能作用。
GnRH激动剂(GnRH agonist，GnRHa)是近年来被广泛应用于实验研究和临床研究的化疗时卵巢保护药物。其保护卵巢的机制有众多学说，其中“性腺休H民”学说是GnRH激动剂保护化疗卵巢的主要理论基础。然而，GnRH激动剂主要通过对垂体GnRH受体的降调节和垂体促性腺激素细胞的脱敏作用而抑制促性腺激素释放，其发挥生物学作用的靶点主要为促性腺激素依赖性的卵泡；化疗条件下大量丢失的原始卵泡并不表达FSH受体或GnRH-I受体；这种空间上的表达分离似乎很难解释GnRH激动剂对于化疗卵巢储备能力的保护效应。如何将GnRH激动剂的作用位点，与原始卵泡的丢失联系起来呢?假定表达于小生长卵泡和早期窦卵泡却作用于原始卵泡的AMH，在此过程中发挥了重要的“桥梁”作用。因此，本研究的第二个目的是观察GnRH激动剂和环磷酰胺联合作用下卵巢局部AMH的表达和变化规律，并探讨AMH在介导GnRH激动剂保护化疗卵巢过程中的可能作用。
化疗药物引起卵巢功能低下或衰竭的机制有两种可能：第一，原始卵泡的不完全或完全丢失，致卵巢储备能力降低；第二：在仍有一定原始卵泡储备的情况下，化疗药物引起卵巢局部微环境的紊乱。本研究的第三个目的为：观察环磷酰胺注射后8周卵巢局部的微环境状态，包括卵巢间质的病理特征，卵巢局部旁分泌因子SCF和促性腺激素受体FSHR的表达，为未来选择性添加旁、自分泌因子改善化疗卵巢微环境探讨可能性。
方法：
(一)环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤的实验研究采用完全随机分组方法，将大鼠随机分为2组：单次腹腔注射生理盐水或环磷酰胺。于结束用药的一周内(第1天/D1，第3天/D3，第7天/D7)和第8周(W8)处死动物。取双侧卵巢并称湿重。一侧卵巢固定后连续切片，HE染色并进行卵泡计数，AMH免疫组化检测AMH蛋白表达水平和AMH阳性的卵泡数目。另一侧提取mRNA后，使用荧光定量PCR方法检测AMH mRNA的表达。用药8周后用免疫组化方法检测大鼠卵巢SCF蛋白的表达，RT-PCR方法检测大鼠卵巢SCF mRNA的表达，荧光定量PCR方法检测大鼠卵巢FSHR的表达。
(二)长效GnRH激动剂对化疗大鼠卵巢的作用及其机制研究采用完全随机分组方法，将大鼠随机分为6组：正常对照组，CPA组，GnRHaA组，GnRHa B组，GnRHa+CPA同时注射组，GnRHa+CPA间隔注射组。生理盐水对照组和CPA组单次腹腔注射生理盐水或环磷酰胺。GnRHa A组：达菲林肌肉注射后，立即腹腔注射生理盐水。GnRHa B组：达菲林肌肉注射14天后，腹腔注射生理盐水。GnRHa+CPA同时注射组：达菲林肌肉注射时同时腹腔注射环磷酰胺。GnRHa+CPA间隔注射组：达菲林肌肉注射14天后CPA单次腹腔注射。于CPA结束用药的第1周内(D1，D3，D7)分别处死动物。无菌状态下开腹，取双侧卵巢称重。使用生理盐水冲沈局部血液，立即投入10％甲醛固定12～24h，而后进行光镜样品的制作和备作免疫组化。
结果：
1) 卵泡计数环磷酰胺注射后D1，D3，D7和W8原始卵泡计数显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。环磷酰胺注射后W8与环磷酰胺注射后D7原始卵泡数目差异无显著性(P>0.05)。与生理盐水对照组相比，原始卵泡(PMF)计数在D1、D3，D7和W8分别是67％，54％，47％和44％。环磷酰胺注射后D1或D7生长卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)；环磷酰胺注射后D3或W8生长卵泡数与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。环磷酰胺注射后各个时间点窦卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。与相应时间点对照组相比，生长卵泡在D1、D3，D7和W8分别是76％，87％，57％和94％。 GnRHa注射组与生理盐水对照组原始卵泡数差异无显著性(P>0.05)。GnRHa+CPA同时注射组原始卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)；GnRHa+CPA同时注射组各时间点原始卵泡数目显著高于CPA组(P<0.05)。GnRHa+CPA间隔注射组原始卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)；GnRHa+CPA问隔注射组各时间点原始卵泡数目高于CPA组，但差异无统计学显著性(P>0.05)。
2) AMH的表达AMH主要表达于初级卵泡、次级卵泡和早期窦卵泡的颗粒细胞。原始卵泡和排卵前卵泡未见AMH的表达。部分闭锁卵泡可见弱表达。在生理盐水对照组，动情周期的不同阶段AMH免疫组化评分(Immunoreactive scoring，IRS)有波动，但差异无统计学显著性(P>0.05)。
环磷酰胺注射后D1，D3，D7和W8卵巢AMH IRS和AMH阳性卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。环磷酰胺注射后W8 AMH IRS和AMH阳性卵泡数目显著高于环磷酰胺注射后D7(P<0.05)。环磷酰胺注射后D1，D3，或D7卵巢AMH mRNA显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。相关分析表明，AMH阳性的卵泡数目与AMH IRS呈显著正相关(r=0.863，P<0.01)。AMH阳性的卵泡数目与原始卵泡计数呈显著正相关(r=0.773，P<0.01)。
GnRHa A组注射后D1和D3 AMH阳性的卵泡数目高于生理盐水对照组相应时间点，但差异无统计学显著性(P>0.05)。GnRHa A组注射后D7天AMH阳性卵泡数目低于生理盐水对照组，但差异无显著性(P>0.05)。GnRHa +CPA同时注射和间隔注射组各时间点AMH阳性的卵泡数目显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。GnRHa+CPA同时注射组D1和D3 AMH阳性的卵泡数目显著高于CPA组相应时间点(P<0.05)， GnRHa+CPA同时注射组D7 AMH阳性卵泡数目与CPA组相应时间点相比，差异无统计学显著性(P>0.05)。与CPA组相应时问点相比，GnRHa+CPA间隔注射组AMH阳性的卵泡数目差异无统计学显著性(P>0.05)。 3) SCF和FSHR的表达生理盐水对照组SCF蛋白主要表达于卵巢原始卵泡和窦前卵泡的卵母细胞，次级卵泡和早期窦卵泡的颗粒细胞也可见表达，晚期窦卵泡颗粒细胞表达较弱。环磷酰胺处理组窦卵泡颗粒细胞可见较强SCF蛋白表达。环磷酰胺组8周时大鼠卵巢颗粒细胞SCF IRS显著高于生理盐水对照组(P<0.05)；卵母细胞IRS显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。环磷酰胺注射后8周时卵巢SCF mRNA显著高于生理盐水对照组(P<0.05)；环磷酰胺组注射后8周FSHR mRNA的水平显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。
结论：
1．AMH可能介导了环磷酰胺诱导的大鼠原始卵泡丢失。
2．长效GnRH激动剂对于环磷酰胺诱导的大鼠原始卵泡丢失有一定保护作用。
3．GnRH激动剂和环磷酰胺同时用药卵巢AMH的升高可能部分阻断了CPA诱导的原始卵泡丢失，从而在一定程度上发挥了卵巢保护作用。GnRH激动剂和环磷酰胺抑制方案(间隔用药)卵巢AMH阳性卵泡数目较低，提示GnRH激动剂可能通过其它因子发挥作用。
4．环磷酰胺作用下卵巢SCF和FSHR的异常表达可能与化疗卵巢功能低下有关。