人趋化因子CCL11和CCL24的表达、纯化及性能表征

• 作 者: 杨秋霞
• 机 构: 中国石油大学(华东)
• 出 处: 中国石油大学(华东)
• 发表日期: 2012年期
• 关键词: 趋化因子 药物靶点 信号传导途径 过敏性哮喘

趋化因子CCL11和CCL24都属于β趋化因子或CC趋化因子家族的成员,以近N-端处有2个相邻的半胱氨酸为特征。目前越来越多的研究表明CCL11、CCL24的受体CCR3在炎症反应、过敏性哮喘等疾病中发挥着关键作用,是重要的药物靶点,通过阻断CCR3的信号传导途径将有望大大缓解或彻底治愈炎症及过敏性哮喘等相关疾病。作为趋化因子的重要成员,其研究受到了广泛的关注。　　
在大肠杆菌中对目标蛋白进行过量表达,以获得毫克至几十毫克级具有活性的蛋白,是在体外对蛋白进行深入研究的通常做法。但是,目前,CCL11、CCL24在大肠杆菌中主要是以包涵体的形式进行表达,活性较低需要对其进行复性,步骤繁琐。为了解决这一问题和进一步研究CCL11、CCL24的生物化学、生物物理性质及其与受体CCR3间的作用机制,本论文通过PCR扩增人CCL11、CCL24成熟蛋白的基因,将其插入表达载体,获得目的蛋白的重组表达质粒。通过表达条件的优化获得了融合蛋白的最佳表达条件:即表达载体选用pET28a,宿主菌选用大肠杆菌BL21(DE3),CCL11融合蛋白的诱导时机为OD600m=1.2～1.4,CCL24融合蛋白的诱导时机为OD600m=0.8-1.0,诱导剂浓度为0.5mM IPTG,培养温度为25℃。经Ni2+亲和色谱柱、TEV酶切等步骤建立了目的蛋白的纯化方法,并通过SDS-PAGE、Western blot、质谱等对蛋白进行初步表征。通过圆二色光谱仪、荧光光谱仪对蛋白的二级结构和在变性剂下的稳定性进行了分析:CCL11、CCL24均给出预期的圆二色光谱,表明其已正确折叠;CCL11在7.0M的尿素或5.0M的盐酸胍中能够完全变性,而CCL24在7.0M的盐酸胍才能完全变性,在相同的变性剂浓度下,CCL24在变性剂中的稳定性比CCL11高。蛋白在盐酸胍中的折叠动力学研究表明,CCL11、CCL24的折叠均存在中间态,且其动力学过程存在明显差异。通过细胞内钙流实验和荧光各向异性实验,发现目的蛋白可以和受体CCR3结合,并引起细胞内的钙离子释放,证明重组蛋白具有一定的生物学活性。这为进一步研究CCL11、CCL24与CCR3间的相互作用机制以及相关疾病的治疗奠定了基础。