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晶状体是眼睛中重要的聚光系统,成熟的晶状体主要是由晶状体上皮细胞以及由晶状体上皮细胞分化形成的晶状体纤维细胞组成的。晶状体纤维细胞的亚细胞器在其成熟过程中将会降解,晶状体上皮细胞是成熟的晶状体中唯一具有分裂和分化能力的细胞。晶状体中亚赤道区域的细胞晶状体上皮细胞不断通过退出细胞周期进入细胞分化形成晶状体纤维细胞,终生对晶状体的生长起着重要的作用,而晶状体前方中央的干细胞样上皮细胞则不断分裂补充亚赤道区域的晶状体上皮细胞。同时,晶状体上皮细胞也是整个晶状体代谢的中心,在保护整个晶状体的透明性和内环境稳定上起着关键作用。晶状体上皮细胞的功能紊乱或者异常的凋亡都会引发白内障等眼睛疾病的发生。因而,对晶状体上皮细胞的研究是眼睛发育和病变研究者中的重要课题。在晶状体上皮细胞在分裂分化形成纤维细胞以及维持晶状体内环境的稳定性的过程中,成纤维细胞生长因子、自分泌产生的促骨骼生长因子以及Notch信号通路等一系列的分子信号通路通过诱导不同的因子的时空特异性表达实现晶状体的发育以及功能行使。另外,已有的大量研究结果表明转录因子Pax6在晶状体发育中起着重要的调控作用,并且Pax6的活性受到磷酸化和SUMO化的翻译后修饰调节。而最近的研究结果也表明另外一个重要的转录因子CREB也参与晶状体发育的调节。转录因子CREB在在真核生物中普遍存在,并且CREB S133位点的磷酸化是其被激活的关键,蛋白激酶A、促分裂原活化蛋白激酶等蛋白激酶都能够通过磷酸化S133位点激活CREB的活性从而调控基因表达。另一方面,本实验室已有的研究结果也表明蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A能介导CREB去磷酸化调节晶状体上皮细胞的分化。然而,关于转录因子CREB及其磷酸化与去磷酸化在晶状体发育与功能中的调节作用以及调节机制还有待进一步的研究。本研究的主要目的就是探讨CREB以及它在S133位点的磷酸化状态在晶状体上皮细胞具体的调节作用以及调节机制。本研究首先得到并扩增了pCI-Neo空载体、野生型CREB表达载体pCI-WT-CREB、模拟CREB持续性去磷酸化状态的突变体表达载体pCI-S133A-CREB以及模拟CREB持续性磷酸化状态的突变体表达载体pCI-S133D-CREB,并将这些表达载体分别转染了小鼠晶状体上皮细胞αTN4-1细胞,得到了四种不同的稳定细胞系,这四种稳定细胞系的成功构建是后续实验开展的基础。通过对比αTN4-1细胞与四种不同稳定细胞系的形态特征发现这些表达载体的表达都引起了细胞形态的改变。其中,最为突出的是野生型CREB过表达的细胞伸长并出现纤维化,与晶状体纤维细胞的形态相似。另外,通过对不同细胞系中CREB蛋白的进行半定量分析发现并证实了CREB在S133位点的磷酸化能够促进CREB蛋白的稳定性,而去磷酸化则会降低CREB的稳定性。然后,为了研究CREB及其磷酸化状态对晶状体发育的调节,分析了野生型以及突变体CREB的过表达对晶状体上皮细胞增殖和分化的影响。结果发现,野生型的CREB会抑制晶状体上皮细胞的增殖同时促进晶状体上皮细胞的分化,突变体CREB的过表达并没有相同的作用,反而促进了晶状体上皮细胞的增殖。野生型CREB过表达的稳定细胞系在没有血清的条件下诱导5天与bFGF诱导的αTN4-1细胞一样形成了相似的类晶体结构,并且有晶状体上皮细胞分化标志β-晶体蛋白的表达,这些结果说明野生型CREB与bFGF的调节作用相似,都可以通过促使晶状体上皮细胞退出细胞周期进入细胞分化。接着,为了探究CREB及其磷酸化对晶状体上皮细胞对外界刺激的应激能力的影响,通过磷酸酯酶抑制剂冈田酸（OA）诱导了并分析了不同细胞系的细胞凋亡。结果发现野生型CREB的过表达导致了晶状体上皮细胞的抗凋亡能力显著下降。进一步的研究显示,野生型CREB过表达细胞抗凋亡能力的下降主要是由于CREB对αB-晶体蛋白表达的抑制作用引起的,而通过在pCI-WT-CREB-αTN4-1稳定细胞系中过表达αB-晶体蛋白能够提高该细胞系的应激自我保护能力。最后,为了研究野生型CREB对αB-晶体蛋白的负性调节机制,首先通过生物信息学分析查找出了CREB在小鼠αB基因上可能的结合位点并通过凝胶迁移阻滞实验证实了CREB在小鼠αB基因上的结合位点的序列为-61TGACCTCA-54,然后通过荧光素酶报告基因检测再次证实了转录因子CREB与αB基因的启动子结合并抑制αB-晶体蛋白的表达。总结以上实验结果,本研究论文首先证实了前人对于CREB的磷酸化能够提高其稳定性的研究,并发现CREB的去磷酸化导致其稳定性下降;其次,首次发现并提出野生型CREB通过促进晶状体上皮细胞周期退出进入细胞分化,这一发现为晶状体的发育研究提供了新的切入点;然后,首次发现野生型CREB抑制晶状体上皮细胞中αB-晶体蛋白的表达导致晶状体上皮细胞的抗凋亡能力的下降,这一研究结论将为后发性白内障的预防与治疗提供新的理论基础;再次,揭示出野生型CREB通过与αB基因启动子-61TGACCTCA-54序列相结合从而抑制其表达。最后,提出CREB的功能不仅受到磷酸化状态的影响,还受到其它因素的调节。