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目的:确定成熟表皮细胞去分化现象的发生,并探讨Wnt信号通路与成熟表皮细胞去分化之间的关系,为组织修复与再生提供理论基础。
方法:
1.在体皮片移植实验:人包皮皮片去基底细胞层后移植于全层皮肤缺损的BALB/c裸鼠背部,常规饲养5天后取出移植的皮片(成活的皮片),免疫组化及流式细胞术检测CK10、CK19及β1整合素的表达变化;并同时采用反转录PCR及定量PCR检测皮片移植前后Wnt分子(Wnt1、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt10b、Wnt11)的表达变化;Western blot检测Wnt下游(β-cate-nin、cyclinD1、c-myc)及支路分子(P-PKC、P-JNK)的表达变化。
2.体外诱导去分化实验:培养成熟的表皮细胞,分正常培养组(不加诱导剂),诱导去分化组(诱导剂为Licl或GSK3β抑制剂),培养3天后Western blot检测各组细胞中β-catenin的表达;并进行免疫细胞化学检测CK10、CK19及β1整合素阳性的细胞;倒置相差显微镜下观察细胞克隆形成情况;流式细胞术检测过渡阶段的细胞传代后的增殖指数,以评价细胞是否发生去分化。
结果:
1.人包皮皮片去基底细胞层后,整个皮片几乎均成CK10染色阳性;而移植后,皮片内侧出现CK10阴性及CK19和β1整和素染色阳性的细胞,流式细胞术检测结果显示:移植后CK10阳性细胞比例下降、CK19阳性和β1阳性细胞比例明显增加(P<0.01)。PCR检测结果显示:随移植时间的延长,皮片内Wnt10b、Wnt4、Wnt7a表达明显增加,移植3天后分别为对照组的3.1、2.2、1.4倍;移植5天后分别为对照组的4.2、3.4、2.4倍。Western blot检测结果显示:β-catenin、cyclinD1、c-myc表达也明显增加(P<0.01),而P-PKC、P-JNK蛋白表达没有明显变化。
2.体外培养的成熟表皮细胞经Wnt通路活化剂(Licl或GSK3β抑制剂)诱导后,表皮细胞在高表达β-catenin的同时,CK19及β1整合素的表达也明显增强,并且在传代后呈克隆式生长,并表现出较强的增殖能力。
结论:创伤微环境可诱导成熟表皮细胞的去分化,其中Wnt/β-catenin信号通路的活化起着关键的调控作用。