广东省猪胞内劳森菌流行病学调查与分离鉴定

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猪增生性肠炎是一种由专性胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的猪小肠黏膜腺窝上皮细胞腺瘤样增生的接触性传染病。该病在世界范围内广泛流行,临床上常见腹泻,生长缓慢,饲料转化低,少见急性死亡,给养猪业造成极大经济损失。本论文对广东省猪的胞内劳森菌进行了流行病学调查和分离鉴定。  根据La等(2005)报道的胞内劳森菌16S rDNA特异性引物,建立了胞内劳森菌PCR检测方法。该法能够特异性扩增出靶基因的655 bp的片段,而对产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球、猪痢疾螺旋体、猪结肠螺旋体均不能扩增,将胞内劳森菌的基因组DNA进行梯度稀释和PCR扩增,其最小检出量为0.04 ng/μL,具有较高的特异性和敏感性。基于此方法对采自广东不同地区的577份临床样品进行检测,结果显示在广东各个地区猪群都有胞内劳森菌的感染,猪群的总体阳性率达16.29%(94/577),其中≤35日龄猪的阳性率为8.6%(3/35),29-60日龄阳性率为11.90%(20/168),61-90日龄阳性率为25.48%(53/208),90-120日龄阳性率为10.57%(13/123),121-150日龄阳性率为27.77%(5/18),由此可见广东地区猪群的胞内劳森菌感染率较高。  根据胞内劳森菌的16S rDNA和人喉癌上皮细胞(Hep-2)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)基因设计合成特异性的引物和TaqMan探针,分别建立实时荧光定量PCR检测方法。该方法只对靶基因有信号,其相关性方程分别为CT(LI)=-3.31810g×(conc)+38.840;CT(Hep-2)=-3.304×log(conc)+27.522,扩增效率分别为E(LI)=1.00/E(Hep-2)=1.00,介于0.9和1.2理想值之间,对质粒标准品最低检出量为16S rDNA5.55copies/μL,gadph1.98 copies/μL。重复性检测的变异系数低于5%,这说明FQ-PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好的特点,具有较好的实用性,其标准曲线理想,能准确定量DNA样品中靶基因的拷贝数,适合于对临床样品和体外培养物进行定性和定量检测。  本研究在8%O2、6.2%CO2、79.6%N2、37℃的条件下,采用Hep-2细胞分离培养获得了胞内劳森菌广东分离株(GD-1株)。且在临床上用GD-1株108的感染剂量感染猪,7天后感染猪开始排菌,在第28天剖检,其病理变化与自然感染猪相似,说明该分离株具有很强致病性,这为后续试验提供了重要的实验材料。
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