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葡萄(Vitis vinifera)是葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)的植物,目前选育优质无核葡萄新品种已经成为葡萄育种的首要目标之一,而雄性不育是导致果实无核的重要遗传因素之一,果树上利用雄性不育作母本进行杂交可简化育种程序,提高无核率。’钟山红’(雄性不育)、’魏可实生-3’、’魏可实生-12’都是’魏可’自交后代,是从’魏可’(可育)葡萄自交后代中选育出来的单株,种子于2008年播种,2011、2012年发现’魏可实生-3’、’魏可实生-12’在开花、结果过程中部分表现出类似于雄性不育的异常表现。本实验以’魏可’、’钟山红’以及其他两个’魏可’自交后代单株:’魏可实生-3’、’魏可实生-12’为试验材料,对其葡萄花器官特征、花粉萌发率、花粉粒形态、成熟花粉粒内部结构以及小孢子发育过程细胞学特征进行观察,研究了葡萄半不育单株的不育特性;并采用实时荧光定量RT-PCR技术分析了花药发育相关基因的表达;采用同源克隆的方法,获得了可能与花药发育及雄性不育相关的差异表达基因VvMYB4、VvAMS,并采用生物信息学方法对其结构特征进行分析;对雄性不育相关基因VvMYB4转化番茄,验证了该基因的功能。主要研究结果如下:1.’魏可实生-3’和’魏可实生-12’单株的主要特征是:花丝卷曲,花丝短于花柱,花药内花粉量少,花粉萌发率10%左右,花药中既有正常长球形花粉粒也有异常的近球形花粉粒;’魏可实生-3’双核期绒毡层未完全降解,绒毡层细胞中的营养物质滞留没有及时供应小孢子的发育,致后期部分小孢子败育;’魏可实生-12’绒毡层细胞在单核早期就大部分降解而导致营养供应异常,使部分小孢子败育。研究表明,’魏可实生-3’的花粉败育发生在单核晚期至双核期,’魏可实生-12’的花粉败育发生在单核早期;部分药室绒毡层的异常降解,小孢子发育营养供应不均衡是导致’魏可实生-3’和’魏可实-12’花粉半不育发生的主要原因。2.’钟山红’AG、A6、TDF1、AMS、ACOS5、CYP71A基因表达量不足,SPL基因双核期过量表达,TDP1基因四分体时期过量表达,MYB33/65、MYB4基因过量表达,DYT1基因减数分裂期表达量不足、四分体时期至花粉成熟期过量表达,MS2基因减数分裂期过量表达、四分体时期表达量不足;魏可实生-3’AG、EXS、MYB4、AMS基因过量表达,SPL、A6、MYB33/65、ACOS5基因表达量不足,TPD1基因减数分裂期表达量不足,TDF1基因减数分裂期表达量不足、单核早期过量表达,DYT1基因减数分裂期表达量不足、四分体时期至花粉成熟期过量表达,MS2、CYP71A基因减数分裂期过量表达、四分体时期表达量不足;’魏可实生-12’AG、SPL、A6、MYB33/65、AMS、ACOS5、CYP71A基因表达量不足,EXS、MYB4基因过量表达,TPD1基因减数分裂期表达量不足,TDF1基因双核期过量表达,DYT1基因减数分裂期表达量不足、四分体时期至花粉成熟期过量表达,MS2基因减数分裂期过量表达、四分体时期表达量不足。研究表明,’钟山红’、’魏可实生-3’和’魏可实生-12’AG、EXS、SPL、TPD1基因异常表达可能影响了下游胼胝质代谢相关基因A6、MYB33/65、TDF1基因表达,然后改变了绒毡层降解相关基因AMS、MYB4基因的表达,导致绒毡层降解异常,而且还影响了 MS2、ACOS5、CYP71A基因表达,花粉外壁发育缺陷。3.葡萄VvAMS基因,基因长2241bp,包括363bp的3’-非翻译区,3’-UTR含有25bp的polyA结构,开放阅读框为1878bp。’魏可’、’钟山红’和’魏可实生-3’VvAMS基因序列相似性为99.82%,该基因编码625个氨基酸,该氨基酸具有AMS蛋白典型的bHLH结构域,与可可AMS基因亲缘关系最近。基因编码蛋白质的分子量为69.57 KDa,等电点为4.94,与NCBI中其他植物的AMS蛋白序列相似性大于90%。该基因编码的蛋白不含有跨膜区,不含信号肽,为亲水性蛋白,α-螺旋是VvAMS蛋白的主要组成部分,β-折叠、随机卷曲和β-转角分布于蛋白序列中。4.’魏可’、’钟山红’和’魏可实生-3’的VvMYB4基因的序列相似性为99.80%,基因编码蛋白的相似性为99.77%,该基因在品种间相似性较高;将VvMYB4基因转到’MicroTom’番茄中,经过潮霉素筛选,获得转基因抗性株系,GUS瞬时表达检测7个抗性株系,结果均呈阳性;经过PCR检测,5个GUS阳性株系均检测到目的条带;进一步RT-PCR检测,初步证实,有4个生根株系的VvMYB4基因已经整合到’Micro Tom’番茄中;转基因番茄的花药略有张开,闭合不紧密,花粉含量少且生活力、萌发率低;转VvMYB4番茄中MYB4基因过量表达抑制了苯丙氨酸途径中PAL、C4H、C3H、COMT、DEX、FLP、CHS、CHT、F3H和FLS基因的表达,推测基因表达量不足抑制孢粉素和类黄酮物质的合成,进而影响花粉外壁的形成。