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本研究以广东地方优良柑桔品种暗柳橙为实验材料,以暗柳橙实生黄化苗上胚轴切段为转化受体,利用农杆菌介导法将CaMV35S启动子驱动的胰岛素(INS)基因(35S::INS)、CaMV35S组成型启动子和笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)分别驱动的柑桔偏好密码子编码的抗菌肽D(CAPD)基因(35S::CAPD和PSP::CAPD)进行遗传转化研究。此外,以无籽沙糖桔黄化实生苗上胚轴切段为材料,建立高效的无籽沙糖桔离体再生体系,以期为无籽沙糖桔提高抗病性等基因工程育种奠定基础。 主要研究结果如下: (1)转35SP::INS研究中,共转化4批暗柳橙黄化实生苗上胚轴切段1488个,经多次继代和筛选培养,获得54个抗性芽,通过生根培养和微芽嫁接获得抗性植株5株。用35SP、nptⅡ和ChvA引物对所得5株抗性苗进行PCR检测,结果显示,5株均为35SP阳性,且ChvA阴性,而其中4株nptⅡ呈阳性。采用EcoRⅠ单酶切,以nptⅡ片段为探针,对4株nptⅡ阳性植株进行Southern blot检测,结果表明,其中2株呈阳性,且分别为1位点插入和2位点插入的转化植株。 (2)转35SP::CAPD研究中,共转化9批暗柳橙黄化实生苗上胚轴切段2991个,经多次继代和筛选培养,获得239个抗性芽,通过诱导生根以及微芽嫁接技术获得抗性植株24株。分别用35SP、nptⅡ和ChvA引物进行PCR扩增,结果显示24株ChvA均呈阴性,其中7株35SP和nptⅡ均呈阳性,另有11株仅35S呈阳性。选取2株nptⅡ阳性植株进行Southern blot检测,表明该2株均呈阳性,且分别为1位点插入和2位点插入的转化植株。 (3)转PSP::CAPD研究中,共转化9批暗柳橙黄化实生苗上胚轴切段3019个,经过多次继代和筛选培养,获得261个抗性芽,通过诱导生根以及微芽嫁接技术获得抗性植株68株。分别用PSP、nptⅡ和ChvA引物对其进行PCR扩增,结果显示54株ChvA呈阴性,其中11株PSP和nptⅡ均呈阳性,另有2株仅PSP呈阳性。选取7株nptⅡ阳性植株进行Southern blot检测,表明仅1株呈阳性,且为1位点插入的转化植株。 (4)通过探讨不同6-BA、IAA浓度及其配比对无籽沙糖桔离体再生的影响,建立了较为高效的无籽沙糖桔离体再生体系。结果表明以MT为基础培养基,添加3.0mg/L的6-BA和0.3 mg/L的IAA的培养基诱导芽的再生效果最好,每个外植体平均可再生不定芽4.2个,芽再生率达90.48%。