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高效的基因组编辑方法是生物学基础和应用研究的核心技术，是细菌生理功能研究、代谢调控机理分析和基因工程菌株构建的先决条件。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性细菌的模式菌，广泛应用于各种生理代谢、信号调控以及系统代谢工程研究，尽管在芽胞杆菌中已建立了反筛方法、位点特异重组酶介导方法以及CRISPR/Cas9等基因组编辑技术，但是现有的方法存在操作过程复杂、外源DNA序列残留、编辑位点受限或假阳性率高等问题，无法高效稳定地对芽胞杆菌等大多数的革兰氏阳性细菌进行基因组编辑。近年来，基于细菌和古菌防御系统建立的高效遗传操作技术是基因组编辑领域的研究热点，如利用限制性修饰(RM)系统建立的DNA甲基化模拟系统(MoDMP)和利用规律成簇的间隔短回文重复序列建立的CRISPR技术。最近发现，毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system)能特异调节细胞生长与休眠，是原核细胞中普遍存在的一种防御系统。因此，利用毒素-抗毒素系统开发新型高效的细菌基因组编辑技术有极其重要的意义。本文以模式菌株枯草芽胞杆菌W168、具有重要工业应用价值的谷氨酸棒杆菌ATCC13032和嗜碱芽胞杆菌Bacillus sp.B001为研究对象，将细菌毒素-抗毒素系统重编程为由抗毒素开关调控的毒素反筛模块(Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch,TCCRAS),并经过优化表达调控元件使其适用于枯草芽胞杆菌、谷氨酸棒状杆菌和嗜碱芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌的基因组编辑。 首先，为精确控制毒素-抗毒素系统的表达，本研究基于组成型与诱导型启动子分别启动毒素与抗毒素基因表达的策略，构建了抗毒素开关调控的毒素反筛模块(TCCRAS)。利用芽胞杆菌组成型启动子PliaG和木糖诱导型启动子PxylA分别表达毒素和抗毒素基因，在枯草芽胞杆菌W168中分别克隆与表达了phd-doc、parDE、relBE、ccdAB和mazEF五种不同来源的Ⅱ型TA系统。通过检测不同的TCCRAS系统对枯草芽胞杆菌细胞生长/休眠的调控能力，筛选得到一个有效的可调控细胞生长/休眠的新反筛模块relBE。 为了在枯草芽胞杆菌中建立高效的基于毒素-抗毒素系统的基因组编辑技术，进一步利用relBE反筛模块构建了枯草芽胞杆菌通用遗传操作载体pWYE486。利用该载体系统，在枯草芽胞杆菌W168中实现了amyE基因和divIVA基因的高效无痕敲除，反筛和突变效率分别为100％和89.6-100％;并实现了37.7kb pps操纵子和194.9kb的染色体区域删除，反筛和突变效率分别为98.1-99.4％和29.5-61.5％。在外源DNA片段插入方面，利用该方法在W168中实现了5-12kb的thrABC操纵子、trp操纵子、trp-thrABC串联大片段和融合的Pspac-crtI-crtE-crtB基因簇的插入，反筛和突变效率分别为98.1-100％和42.3-52.6％，首次在枯草芽胞杆菌中实现了番茄红素的生物合成。在基因替换和精确点突变方面，利用该方法在W168中也成功实现了gfpmut3a基因替换upp基因和recU基因定点突变，反筛和突变效率分别为97.4-100％和57.7-69.2％。 为在谷氨酸棒杆菌中实现高效的基因组编辑，以具有重要工业应用价值的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为研究对象，利用组成型启动子P45和IPTG诱导型启动子Ptac分别表达毒素relE和抗毒素relB基因，构建了适用于谷氨酸棒杆菌基因组编辑的TCCRAS系统。利用遗传操作质粒pWYE587，在谷氨酸棒杆菌ATCC13032实现了upp基因的无痕敲除、cadA基因替换lysE基因以及高达179.8kb染色体区域的删除，反筛和突变效率分别为100％和17.9-85.9％。表明TCCRAS系统用于基因敲除和基因替换的效率均明显高于传统的SacB系统。此外，利用该方法将谷氨酸棒杆菌的lysE基因替换为大肠杆菌的cadA基因，成功地构建了直接发酵法产戊二胺的谷氨酸棒杆菌工程菌，为今后利用谷氨酸棒杆菌生产戊二胺奠定了基础。 为进一步评估TCCRAS系统在其它难以进行遗传操作的细菌中的有效性，将枯草芽胞杆菌relBE TCCRAS系统在嗜碱芽胞杆菌Bacillus sp.B001中进行表达，成功实现了对B001菌株的生长或休眠的调控，表明枯草芽胞杆菌中的TCCRAS系统能够应用于嗜碱芽胞杆菌的基因组编辑，为下一步建立嗜碱芽胞杆菌的高效基因组编辑系统提供了研究基础。此外，为提高菌株B001的蛋白酶产量，通过分式析因设计、最速上升实验、中心复合设计和响应面分析等统计学方法优化了Bacillus sp.B001发酵培养基，蛋白酶产量达到63200U/mL，是优化前的1.84倍，为菌株工业化应用奠定了基础。 本研究通过构建抗毒素开关调控的毒素反筛模块，成功建立了一种新型、高效的基因组编辑技术，在革兰氏阳性细菌中实现了染色体基因的无痕敲除、敲入、替换、点突变及大片段删除和插入。该技术具有不引入任何标记、突变菌株遗传稳定、反筛效率高及用途广等优点，可作为一种有效的遗传操作工具用于基因组学、系统生物学、代谢工程及合成生物学研究。该方法能够在基因组水平高效地实现细菌的代谢工程改造，为人工设计构建高效的细胞工厂实现新型的生物催化剂、重要化合物的生物合成提供技术平台，提升微生物在医药、农业、工业等多个领域中的应用价值。