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生物固氮是固氮酶将大气中的氮还原为氨的过程。植物内生固氮菌(endophytic diazotrophs)是指定殖于植物体内,能与宿主进行联合固氮作用的一类微生物。本研究的目的对分离于两种宿主植物中的内生固氮菌的遗传多样性分析和生化特性进行分析,并对固氮菌新种做了鉴定。具体的研究结果如下:
1、内生固氮菌的遗传多样性
试验以野生稻的根、茎、叶为材料,共分离筛选到113株内生固氮菌,各菌株表现出的固氮活性差异很大,从最低的1.26 nmol mL-1·h-1 C2H4至最高的2173.07 nmolmL-1·h-1 C2H4。采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳将这些菌株进行初步归类,在80％的相似性水平上,聚为12个类群,IS-PCR电泳图谱聚类结果与之有很好的一致性。各类群代表菌株的16S rRNA基因部分序列分析结果表明:各类群代表菌株分别与肠杆菌Enterobacter,克雷伯氏菌Klebsiella和Burkholderia亲缘关系较近。其中类群Ⅲ、类群Ⅶ和类群Ⅷ的代表性菌株B23T,B69和B80的相似系数较低,可能代表一个新种或一个新属。
2、内生固氮菌的生理生化特征分析
供试的12个类群固氮特性和生理生化研究结果表明:类群之间存在差异,进一步证明了所分离菌株的遗传多样性和各类群菌株参与的不同生理生化反应。碳源利用研究表明供试的95中碳源中类群Ⅸ可利用的碳源最多,达到53种,类群Ⅷ可利用的碳源最少,只有23种,在整个研究中,供试菌株均不能利用的碳源为:L-苏氨酸,尿素,肌苷、草酸钠,D-阿拉伯糖,胰岛素。各类群代表菌株在不同浓度的各类抗生素条件下,生长状态表现不同,类群Ⅳ和类群Ⅷ的代表性菌株可在供试抗生素的所用浓度下生长,而其他类群均有不同程度的抑制作用。各类群代表菌株最适生长pH为5.0～10.0,且对NaCl的耐受性都很强,各类群代表性菌株的最适生长时间为24到48小时之间。适宜温度范围为30～35摄氏度,NH4+离子浓度对各类群代表性菌株的固氮活性有显著影响。这些研究结果将为以后新种的研究与鉴定提供依据。
3、野生稻Oryza alta中分离的新型内生菌Acinetobacter oryzae sp.的遗传多样性分析及分子鉴定
野生稻Oryza alta分离的内生固氮菌种中,挑选类群Ⅲ的代表菌株B23T作为研究对象,观察发现B23T菌落形态呈圆形,凸起,表面光滑,略不透明。B23T为革兰氏阴性菌。在30℃培养24小时和48小时后,B23T菌落直径分别为1.5-2.0 mm和2.5-3.0 mm。B23T在10-41℃都能生长,但最适生长温度范围在28-35℃。根据不同的培养测定,B23T的生长适宜pH范围在4-10之间,对NaCl的最大耐受浓度为5％,在氨苄青霉素浓度分别为5,50和300μg·ml-1时都具有抗性,B23T对氯霉素,链霉素,新霉素,红霉素的抗性浓度为5μg·ml-1。具有明胶水解酶,过氧化氢酶,转氨酶活性,但不产IAA,硝酸盐还原和脲酶活性。能够利用的碳源有糊精,(D)-甘露糖,(D)-半乳糖,(D)-果糖,(D)-蜜二糖,龙胆,(D)-纤维二糖,左旋鼠李,(D)-木糖,木糖,(D)-核糖,(D)-甘露醇,木糖醇,(D),左旋lacatate,左旋苹果酸,尿苷,甘油,(D)-葡萄糖酸,左旋鸟氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-天冬氨酸酸,(D)-葡萄糖,麦芽糖,(D)-海藻糖,(D)-山梨醇,α-酮戊二酸,,内啡肽-羟基苯基乙酸,(D)-葡萄糖酸,钠琥珀酸,,水杨苷,(D)-galacturonate,N-乙酰-(D)-氨基葡萄糖,L-谷氨酸酸,L-丙氨酸,(D)-丙氨酸和L-色氨酸。经PCR扩增16S rRNA序列,结果表明与B23T遗传关系最近的是Acinetobacter johnsonii LMG 999T和Acinetobacter haemolyicus LMG 996T,种系距离分别为89％和90％。B23T与模式株Acinetobacter johnsonii LMG 999T和Acinetobacter haemolyticus LMG 996T的DNA-DNA的杂交率分别为41％和32％。B23+的G+C含量为44.6(mol％)。将B23T与Acinetobacter属的相关菌株进行了以下研究:IS-PCR指纹图谱和全蛋白SDS-PAGE电泳,比较了生化试验、耐药性、表型、细胞内脂肪酸的含量及扫描电子显微镜观察,结果存在差异,这表明代表株B23T与以往所描述的种有显著不同。基于以上结果,可以将B23T列为一个新种,定名为Acinetobacter oryzae sp.nov.将代表株B23T指定为模式株。它是从生长于中国的亚热带野生水稻Oryza alta中分离得到的。