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在高产育种及株型改良中,叶片性状一直是水稻遗传育种家关注的焦点.尽管水稻中卷叶材料比较丰富,但对其遗传和分子生物学研究却比较缺乏.因此利用不同的卷叶材料,分析控制叶片生长发育的基因及其分子调控机理,对研究植物叶片发育的分子生物学具有重要的理论意义。
本研究以中花11及来源于中花11的T-DNA(Ds)单拷贝插入引起卷叶等多种表型变化的突变体IL39为材料.采用TAIL-PCR的方法获得了IL39的T-DNA旁邻水稻DNA序列,RACE技术克隆候选基因rl8(t)的全长cDNA,RT-PCR及启动子融合GUS基因表达技术分析候选基因的表达模式,过量表达方法验证rl8(t)的功能,反义RNA和RNAi基因敲除技术、外源IAA处理实验进一步探讨rl8(t)的生物学功能,Affymetrix GeneChip(R)基因表达芯片技术初步分析rl8(t)与植物生长相关激素的关系.这为进一步研究rl8(t)的功能奠定了坚实基础。本研究获得的主要结果如下：
1、TAIL-PCR的方法获得了T-DNA旁邻的水稻DNA序列,生物信息学分析旁邻序列,确定RiceGAAS编号AK111023的cDNA为候选基因；RACE技术克隆rl8(t)的全长cDNA,基因结构预测为不含内含子、只含一个793bp的外显子,其ORF大小与RiceGAAS公布的AK111023一致,均为390bp,编码129个氨基酸残基.推测的蛋白序列比较分析显示,rl8(t)为一个未发表的、功能未知的基因.
2、表达分析表明,rl8(t)在IL29的各种组织器官中的表达水平相对于中花11均为明显的上调,且呈剂量变化.利用外源启动子Ubi和r18(t)内源启动子,在中花11中上调表达rl8(t),在TO代转化苗中再现了IL39的突变表型,证明了rl8(t)的过量表达导致了IL39表型的变化.
3、细胞学观察发现,叶片维管束周围薄壁细胞数目明显减少,泡状细胞体积增大.半定量RT-PCR以及rl8(t)启动子与GUS基因的融合表达分析均表明rl8(t)在水稻的根、茎、叶、叶鞘、叶枕、花、种皮和种子等器官中普遍表达.rl8(t)启动子与GUS基因的融合表达在叶枕上最强烈,在叶片上可以观察到GUS表达主要分布在叶脉周围细胞,这可能是由于叶枕具有密集的薄壁细胞、叶脉维管束周围包含大量薄壁细胞所致,这种现象需要通过对GUS表达植株进行细胞学观察来进一步确定.
4、利用反义RNA和RNAi技术对rl8(t)进行了不同程度的基因敲除,由于转基因植株处于幼苗期,尚未观察到明显的表型变化. 5启动子元件预测发现,rl8(t)的启动子区域存在一个ARF-结合元件.外源IAA的添加,中花11和突变体IL39的表型变化没有明显差别,都出现了IAA诱导的表型,但rl8(t)的表达水平均有不同程度的下降,推测rl8(t)可能参与了IAA信号转导的负调控过程.IL39叶枕角度的高度扭曲造成了叶片向背面卷曲,rl8(t)启动子与GUS基因的融合蛋白在水稻叶枕的强烈表达,这是与甾醇类激素BR相关的常见表型.Affymetrix GeneChip(R)基因表达芯片分析IL39相对于中花11的表达谱,发现参与植物生长激素IAA、BR、GA调控的部分基因出现了表达变化,表明rl8(t)可能参与了生长素调控途径的某一过程.
上述研究结果表明,由于T-DNA的插入引起了rl8(t)在水稻突变体IL39中过量表达,造成了植株体内薄壁细胞的变化,从而导致了叶片向背面卷曲等表型变化.rl8(t)可能通过参与激素调控途径的某一过程来调控水稻薄壁细胞的生理过程,从而在水稻生长发育的整个进程中起重要作用.