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研究背景:Fox O1是胰岛β细胞的转录因子之一,在细胞内参与多种信号转导通路,能够调节细胞分化、增殖和凋亡,对胰岛β细胞的功能具有重要影响。Fox O1-EGFP实时成像研究显示,在小鼠胰岛β细胞或MIN6细胞,用3mmol/L葡萄糖孵育时,Fox O1一直在细胞核显著分布。当分别以16.7mmol/L、30mmol/L葡萄糖或116.16ng/m L、1161.6ng/m L胰岛素孵育细胞10-20min时,可检测到胞质荧光增多而细胞核荧光减少。另有研究表明,用25mmol/L葡萄糖刺激MIN6细胞和小鼠胰岛β细胞30min时Fox O1发生急剧磷酸化并且由细胞核转位至细胞质,这一效应具有时间(0.5-2h)和剂量(2.5-20mmol/L)依赖性。而分别以0.58ng/m L、5.80ng/m L、580ng/m L和1161.6ng/m L胰岛素刺激MIN6细胞和小鼠胰岛β细胞同样能够观察到Fox O1发生磷酸化改变,但却未对Fox O1的胞质-胞核转位进行观察。为探讨胰岛素对Fox O1表达部位的影响,本实验拟通过给予不同浓度胰岛素孵育小鼠MIN6细胞,观察不同浓度胰岛素在不同时间对β细胞Fox O1细胞核-细胞质穿梭定位的影响。目的:采用激光扫描共聚焦显微镜对MIN6细胞胰岛素作用后免疫化学染色观察Fox O1在不同浓度刺激不同时间后表达位置的变化。方法:1.小鼠胰岛素瘤MIN6细胞用DMEM(high glucose)培养基(含有25mmol/L葡萄糖、15%FBS、100U/m L青霉素、100μg/m L链霉素)于25ml培养瓶放置在37℃、5%CO2浓度的细胞孵箱中培养。2.分别以含25mmol/L和5.5mmol/L葡萄糖培养基孵育12小时并检测培养上清液胰岛素浓度。3.在含5.5mmol/L葡萄糖培养基基础上给予50μIU/m L(1.75ng/m L)、100μIU/m L(3.5ng/m L)和150μIU/m L(5.25ng/m L)浓度胰岛素分别作用12、24和48小时。4.细胞免疫化学染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察Fox O1的细胞内定位。结果:1.25mmol/L葡萄糖培养MIN6细胞12小时胰岛素分泌浓度为74.37ng/m L,Fox O1主要在细胞质表达;5.5mmol/L葡萄糖培养MIN6细胞12小时胰岛素分泌浓度为37.46ng/m L,Fox O1主要在细胞核表达。2.与对照组相比,胰岛素浓度50μIU/m L组分别在刺激12、24、48小时后Fox O1荧光强度的胞质/胞核比增加,12小时组差异不具有统计学意义(P=0.084),24小时和48小时组存在统计学差异(P<0.05);胰岛素浓度100μIU/m L组分别在刺激12、24和48小时后Fox O1荧光强度胞质/胞核比增加,差异具有统计学意义(P<0.05);胰岛素浓度150μIU/m L组分别在刺激12、24和48小时后Fox O1荧光强度胞质/胞核比增加,均存在统计学差异(P<0.05)。50μIU/m L胰岛素组、100μIU/m L胰岛素组和150μIU/m L胰岛素组分别在不同时间的组内比较存在统计学差异(P<0.05)。结论:1.25mmol/L葡萄糖水平下Fox O1主要表达于细胞质;5.5mmol/L葡萄糖水平下Fox O1主要表达于细胞核。2.外源性胰岛素作用使Fox O1出细胞核转位至细胞质,且与胰岛素浓度和刺激时间的递增成正比。