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炎症性肠病为一类慢性进行性肠道炎症性疾病的总称，溃疡性结肠炎和克罗恩病是其主要的两种类型。其临床表现为肠道屏障功能紊乱、内脏超敏反应、肠道运动功能障碍、抑郁、焦虑、疼痛等，严重影响患者的生活质量和工作效率。现阶段关于炎症性肠病的病因学研究尚未完全明确，可能的因素包括遗传、环境以及患者的易感性、粘膜免疫、肠道菌群等。炎症性肠病的常规治疗包括抗生素、氨基水杨酸、嘌呤类似物、甲氨蝶呤、糖皮质激素类药物，但可能产生恶心、呕吐、烧心、腹泻、头痛、过敏反应、骨髓抑制、肝肾功能损害等一系列副作用。对常规治疗无效的患者还可能会使用肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)等促炎因子的抑制剂。这些治疗虽然改善了疾病的早期症状，但从长远来看可能会使症状恶化。电针作为我国传统医学治疗方法之一，在治疗炎症性肠病的肠道菌群失调、肠道屏障功能损伤、内脏超敏反应、肠道运动功能障碍、抑郁、焦虑、疼痛等方面均有良好效果，因此能够显著提升炎症性肠病患者的生活质量。最近的研究结果显示，电针还可改善炎症性肠病患者临床缓解期的乏力症状。然而，电针治疗炎症性肠病的内在机制尚不明确，制约了在临床治疗炎症性肠病的进一步应用。
腺苷是一种内源性嘌呤核苷，作用于四种受体：A1受体、A2a受体、A2b受体以及A3受体，在结肠以及与情绪相关的基底节区、纹状体、杏仁核、海马、前额叶皮质等脑区均有分布。据报道，腺苷及其受体与炎症性肠病的发病机制有关。激活A1、A2a、A3受体可升高内脏痛阈值、缓解结肠粘膜炎症、保护炎症消化道粘膜层，并减弱结肠运动。而激活A2b受体则会提高肠道上皮促炎因子活性从而加重肠道炎症。另外，在中枢激活A1受体可增强抗焦虑药物的作用，抑制A2a受体可产生抗焦虑的作用。本课题组以往的研究结果显示，电针可明显改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的肠道运动亢进和腹泻症状，并可调控结肠组织A1和A3受体的表达，但几种腺苷受体(A1、A2a、A2b、A3受体)在电针改善炎症性肠病小鼠的内脏炎症痛和焦虑情绪中发挥的作用是否有差异，其外周神经免疫机制是什么，目前尚不清楚，本次研究将进行深入探讨。。
P物质(substance P，SP)是速激肽家族成员之一，参与痛觉信息的传递，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是一种由多种免疫细胞产生的细胞因子，参与激活和调节免疫细胞活性。有研究报道，外周的SP和IL-1β可通过放大疼痛信号、维持炎症肠道的炎症状态等方式，参与炎症性肠病的内脏炎症痛。中枢的IL-1β还有致痛作用。另外，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可通过调控其他神经递质释放产生抗焦虑的作用。那么，电针能否调控这些神经递质或细胞因子，从而缓解炎症性肠病的内脏炎症痛和焦虑情绪，这也是我们将要深入研究的内容。
在痛感觉以及与之伴随的焦虑状态过程中，会涉及到多个脑区以及脑区之间的功能性连接，例如腹侧海马(ventral hippocampus，vHPC)和内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)。vHPC和mPFC均含有丰富的BDNF，疼痛、压力、抑郁焦虑等情况均会导致两个脑区的BDNF减少，并伴有体积萎缩。而海马选择性IL-1β基因敲除可显著缓解脂多糖诱导的小鼠记忆缺陷和焦虑样行为。大量研究报道表明，vHPC通过向mPFC发送带有消极情绪的信号来促进焦虑状态。那么电针能否调控vHPC和mPFC的BDNF和IL-1β表达以及vHPC与mPFC之间的神经环路，从而缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏痛和焦虑，在本次研究中也将深入探讨。
根据以上研究报道和本课题组已有的研究成果，我们提出如下假说：电针可能通过调控外周和中枢的腺苷受体表达，进而调控外周和中枢的致痛递质(SP)、炎症因子(IL-1β)以及神经营养因子(BDNF)的表达以及vHPC和mPFC之间神经环路的激活，从而改善炎症性肠病内脏痛、肠道炎症和焦虑情绪。
在本次研究中，我们使用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)诱导炎症性肠病小鼠模型，首先研究电针是否通过调控外周结肠组织腺苷A1、A2a、A2b、A3受体，抑制结肠组织SP和IL-1β的表达，从而缓解TNBS诱导的炎症性肠病内脏痛和肠道炎症；继而研究电针是否通过调控内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)和腹侧海马(ventral hippocampus，vHPC)的腺苷A1、A2a受体，调控这两个脑区的BDNF、IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的内脏痛和焦虑情绪。最后研究电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠各脑区c-fos的调控作用，并结合文献报道及第二部分的工作基础，采用化学遗传技术兴奋或抑制vHPC-mPFC投射通路，观察能否拮抗或模拟电针镇痛抗焦虑的效应。本课题的研究目的在于探索电针治疗炎症性肠病内脏炎症痛和焦虑情绪的神经生物学机制的切入点，并为电针镇痛抗焦虑的临床应用提供新的思路和治疗策略。
第一部分腺苷受体参与电针治疗TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏炎症痛的外周机制
目的：
(1)采用TNBS诱导的炎症性肠病小鼠模型，研究电针对炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、体重、腹泻、结肠长度以及结肠组织SP和IL-1β蛋白表达水平的影响，确认电针的特异性消炎镇痛作用。
(2)研究电针对炎症性肠病小鼠外周结肠组织腺苷受体表达的调控作用，并在电针前进行腺苷A1、A2a、A2b、A3受体拮抗剂预处理，观察对电针消炎镇痛作用以及SP和IL-1β表达的影响，探讨外周腺苷受体参与电针缓解炎症性肠病小鼠内脏炎症痛的机制。
方法：
(1)造模：小鼠经单次肛门直肠给药方式,每只注射50μlTNBS(5%w/v)与50μl无水乙醇组成的混合溶液，建立TNBS诱导的炎症性肠病模型。
(2)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，电流1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，时间30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
(3)腺苷受体拮抗剂注射：在造模后1天，每次电针治疗之前30min，对TNBS+电针+拮抗剂组小鼠进行腺苷受体拮抗剂预处理。注射方式为每次电针前半小时腹腔注射，连续注射7天。A1受体拮抗剂DPCPX的剂量为3mg/kg，A2a受体拮抗剂ZM241385的剂量为1mg/kg，A2b受体拮抗剂PSB603的剂量为3mg/kg，A3受体拮抗剂MRS3777的剂量为5mg/kg。
(4)行为学检测：通过VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值；运用结直肠扩张(colorectal distension, CRD)实验记录腹部撤退反射(abdominal withdraw reflex score，AWRs)评分；每天记录体重、腹泻评分；取材前测小肠推进率，取材测量结肠长度；
(5)采用Westernblot方法测定结肠组织的A1、A2a、A2b、A3受体以及SP、IL-1β的蛋白表达水平。
结果:
(1)TNBS诱导的炎症性肠病小鼠出现了机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏、体重减轻、腹泻以及结肠长度缩短的症状。电针可显著缓解TNBS诱导的炎症性肠病小鼠的机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、体重减轻、腹泻和结肠长度缩短等症状。而假电针效果不明显。
(2)采用Westernblot方法测定结肠组织致痛因子SP和促炎因子IL-1β的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织的SP与IL-1β的表达显著增多。电针可明显下调小鼠结肠组织的SP和IL-1β的表达，而假电针则无显著效应。
(3)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A1受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A1受体的表达，而假电针组则无显著效应。A1受体拮抗剂DPCPX可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(4)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A2a受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A2a受体的表达，而假电针组则无显著效应。A2a受体拮抗剂ZM241385可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(5)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A3受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A3受体的表达。假电针组可轻度上调模型组小鼠结肠组织A3受体的表达，但仍低于电针组。A3受体拮抗剂MRS3777可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(6)TNBS诱导炎症性肠病组小鼠结肠组织腺苷A2b受体的表达显著增加。电针可以明显下调模型组小鼠结肠组织A2b受体的表达。假电针可轻度下调模型组小鼠结肠组织A2b受体的表达，但仍高于电针组。A2b受体拮抗剂PSB603对电针缓解机械痛觉超敏的作用无显著影响，但进一步增强了电针下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
结论：
(1)电针可显著缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏和肠道炎症，并显著下调结肠组织致痛因子SP和促炎因子IL-1β的表达。证明电针具有特异性消炎镇痛作用。
(2)电针可上调TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织A1、A2a、A3受体的表达，下调A2b受体的表达。A1、A2a、A3受体的上调参与了电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠的消炎镇痛过程。A2b受体下调参与电针抑制内脏炎症反应的病理生理机制。
这些结果提示，电针通过上调外周A1、A2a、A3受体，下调A2b受体，抑制炎症因子SP和IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏炎症痛。
第二部分腺苷A1和A2a受体参与电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的中枢机制
目的：
(1)研究电针对炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、焦虑行为以及mPFC和vHPC的BDNF、IL-1β表达水平的影响，明确电针的中枢镇痛和抗焦虑作用。
(2)研究电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1、A2a受体表达水平的影响，并使用shRNA干扰mPFC和vHPC的A1和A2a受体表达，观察其对电针镇痛抗焦虑作用的影响，从而探讨中枢腺苷受体参与电针缓解炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的机制。
方法：
(1)痛感觉检测：VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值评价机械痛觉超敏；CRD实验记录AWRs评价内脏痛觉过敏。
(2)焦虑行为检测：旷场实验(open field test，OFT)、高架十字迷宫实验(elevated plus maze， EPM)。
(3)Westernblot技术检测小鼠mPFC和vHPC的A1受体、A2a受体、BDNF、IL-1β的表达水平。
(4)脑立体定位注射方法：在造模前三周，对溶媒+A1/A2aR空病毒组、模型+A1/A2aR空病毒组、模型+电针+A1/A2aR空病毒组、溶媒+A1/A2aRshRNA组、模型+A1/A2aRshRNA组、模型+电针+A1/A2aRshRNA组进行注射。注射剂量：每侧注射500nl/只(上海吉凯基因购买)。注射位置：双侧mPFC(AP：+2.5mm，ML：±0.4mm，DV：-2.5mm)，双侧vHPC(AP：-3.5mm，ML：±2.8mm，DV：-3.8mm)。注射时间约17min，注射速度30nl/min,留针约10min。共注射一次。
(5)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
结果：
(1)TNBS诱导的炎症性肠病小鼠出现了机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏，并伴有焦虑情绪。电针可显著缓解TNBS诱导的炎症性肠病小鼠的机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏和焦虑。而假电针则无明显效果。
(2)Westernblot方法测定mPFC和vHPC的抗焦虑因子BDNF、致痛因子IL-1β的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导的炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的BDNF表达明显减少，IL-1β表达明显增多。电针可显著上调mPFC和vHPC的BDNF表达，下调IL-1β受体表达。假电针则无明显影响。
(3)Westernblot方法测定mPFC和vHPC的A1、A2a受体的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导的炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1受体表达明显减少，A2a受体表达明显增多；电针可显著上调mPFC和vHPC的A1受体表达，下调A2a受体表达。假电针则无明显影响。
(4)Westernblot方法检测A1RshRNA和A2aRshRNA的干扰效果。结果显示,分别注射了A1RshRNA和A2aRshRNA的mPFC中A1和A2a受体表达均明显减少。
(5)在mPFC注射A1受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏无明显影响，但减弱了电针改善焦虑的作用，并抑制了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用；在mPFC注射A2a受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏同样无明显影响，但增强了电针改善焦虑的作用，并增强了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用。
(6)在vHPC注射A1受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏无明显影响，但减弱了电针改善焦虑的作用，并抑制了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用；在vHPC注射A2a受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏同样无明显影响，但增强了电针改善焦虑的作用，并增强了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用。
结论：
(1)电针可显著缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏症状以及焦虑情绪，并可上调mPFC和vHPC的抗焦虑因子BDNF表达，下调致痛因子IL-1β的表达。
(2)电针可上调TNBS诱导炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1受体表达，下调A2a受体的表达。干扰mPFC和vHPC的A1受体表达可减弱电针的抗焦虑以及调控BDNF、IL-1β的作用，干扰mPFC和vHPC的A2a受体表达可增强电针的上述作用。但干扰mPFC和vHPC的A1和A2a受体均对电针的缓解痛感觉作用无明显影响。
这些结果提示，电针通过上调中枢A1受体表达、下调中枢A2a受体表达，调控疼痛及焦虑相关因子BDNF和IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的焦虑情绪。
第三部分腹侧海马至内侧前额叶皮质的投射在电针缓解TNBS诱导炎症性肠病痛感觉和痛情绪中的作用
目的：
(1)通过检测各脑区c-Fos的表达来探讨TNBS诱导炎症性肠病模型各脑区神经元激活情况以及电针治疗对激活脑区的影响。
(2)使用化学遗传技术检测腹侧海马至内侧前额叶皮质(vHPC-mPFC)的投射通路参与TNBS诱导炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的过程，以及对电针治疗作用的影响。
方法：
(1)痛感觉检测：VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值评价机械痛觉超敏；CRD实验记录AWRs评价内脏痛觉过敏。
(2)焦虑行为检测：旷场实验(open field test，OFT)、高架十字迷宫实验(elevated plus maze， EPM)。
(3)免疫荧光技术：检测小鼠各脑区的c-Fos表达水平。
(4)化学遗传技术的病毒构建：基于Cre-DIO系统，在vHPC注射顺行DIO病毒rAAV-EF1α-dio-hM3Dq-mCherry-WPRE-pA或rAAV-EF1α-dio-hM4Di-mCherry-WPRE-pA；在mPFC注射逆行Cre病毒retro-rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA(AAV2/R)。hM3Dq兴奋病毒联合Cre重组酶病毒可以激活vHPC-mPFC投射通路；hM4Di抑制病毒联合Cre重组酶病毒可以抑制vHPC-mPFC投射通路。
(5)脑立体定位注射病毒方法：在造模前三周注射病毒。注射剂量：每侧200nl/只。注射位置：双侧mPFC(AP:+2.35mm，ML:±0.35mm，DV:-2.0mm)，双侧vHPC(AP:-2.9mm，ML:±2.5mm，DV:-4.0mm)。注射时间约7min，注射速度30nl/min,留针约10min。共注射一次。
(6)化学遗传操控：在行为学实验或电针治疗60min前向小鼠腹腔注射氯氮平(clozapine N-oxide，CNO)，用于激活hM3Dq或hM4Di。
(7)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
结果：
(1)TNBS诱导炎症性肠病可激活小鼠岛叶(insular cortex，IC)、中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)、前扣带回(anterior cingulate ， ACC)、第二运动皮层(supplementary motor cortex,M2)、丘脑室旁核(thalamic paraventricular nucleus，PVT)、海马(hippocampus, HPC)、内侧前额叶皮质(media prefrontal cortex, mPFC)脑区。电针可抑制TNBS诱导炎症性肠病小鼠IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC脑区神经元活性。
(2)抑制vHPC-mPFC通路可显著改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的焦虑情绪、机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏。
(3)激活vHPC-mPFC通路可拮抗电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏的作用，但对电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠焦虑情绪的作用无显著影响。
结论：
(1)TNBS诱导炎症性肠病会激活小鼠的IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC和mPFC脑区，电针对IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC有调控作用。
(2)vHPC-mPFC下行投射通路参与TNBS诱导炎症性肠病小鼠的痛感觉和痛情绪的调节，并参与了电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠的镇痛过程。
腺苷是一种内源性嘌呤核苷，作用于四种受体：A1受体、A2a受体、A2b受体以及A3受体，在结肠以及与情绪相关的基底节区、纹状体、杏仁核、海马、前额叶皮质等脑区均有分布。据报道，腺苷及其受体与炎症性肠病的发病机制有关。激活A1、A2a、A3受体可升高内脏痛阈值、缓解结肠粘膜炎症、保护炎症消化道粘膜层，并减弱结肠运动。而激活A2b受体则会提高肠道上皮促炎因子活性从而加重肠道炎症。另外，在中枢激活A1受体可增强抗焦虑药物的作用，抑制A2a受体可产生抗焦虑的作用。本课题组以往的研究结果显示，电针可明显改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的肠道运动亢进和腹泻症状，并可调控结肠组织A1和A3受体的表达，但几种腺苷受体(A1、A2a、A2b、A3受体)在电针改善炎症性肠病小鼠的内脏炎症痛和焦虑情绪中发挥的作用是否有差异，其外周神经免疫机制是什么，目前尚不清楚，本次研究将进行深入探讨。。
P物质(substance P，SP)是速激肽家族成员之一，参与痛觉信息的传递，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是一种由多种免疫细胞产生的细胞因子，参与激活和调节免疫细胞活性。有研究报道，外周的SP和IL-1β可通过放大疼痛信号、维持炎症肠道的炎症状态等方式，参与炎症性肠病的内脏炎症痛。中枢的IL-1β还有致痛作用。另外，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可通过调控其他神经递质释放产生抗焦虑的作用。那么，电针能否调控这些神经递质或细胞因子，从而缓解炎症性肠病的内脏炎症痛和焦虑情绪，这也是我们将要深入研究的内容。
在痛感觉以及与之伴随的焦虑状态过程中，会涉及到多个脑区以及脑区之间的功能性连接，例如腹侧海马(ventral hippocampus，vHPC)和内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)。vHPC和mPFC均含有丰富的BDNF，疼痛、压力、抑郁焦虑等情况均会导致两个脑区的BDNF减少，并伴有体积萎缩。而海马选择性IL-1β基因敲除可显著缓解脂多糖诱导的小鼠记忆缺陷和焦虑样行为。大量研究报道表明，vHPC通过向mPFC发送带有消极情绪的信号来促进焦虑状态。那么电针能否调控vHPC和mPFC的BDNF和IL-1β表达以及vHPC与mPFC之间的神经环路，从而缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏痛和焦虑，在本次研究中也将深入探讨。
根据以上研究报道和本课题组已有的研究成果，我们提出如下假说：电针可能通过调控外周和中枢的腺苷受体表达，进而调控外周和中枢的致痛递质(SP)、炎症因子(IL-1β)以及神经营养因子(BDNF)的表达以及vHPC和mPFC之间神经环路的激活，从而改善炎症性肠病内脏痛、肠道炎症和焦虑情绪。
在本次研究中，我们使用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)诱导炎症性肠病小鼠模型，首先研究电针是否通过调控外周结肠组织腺苷A1、A2a、A2b、A3受体，抑制结肠组织SP和IL-1β的表达，从而缓解TNBS诱导的炎症性肠病内脏痛和肠道炎症；继而研究电针是否通过调控内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)和腹侧海马(ventral hippocampus，vHPC)的腺苷A1、A2a受体，调控这两个脑区的BDNF、IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的内脏痛和焦虑情绪。最后研究电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠各脑区c-fos的调控作用，并结合文献报道及第二部分的工作基础，采用化学遗传技术兴奋或抑制vHPC-mPFC投射通路，观察能否拮抗或模拟电针镇痛抗焦虑的效应。本课题的研究目的在于探索电针治疗炎症性肠病内脏炎症痛和焦虑情绪的神经生物学机制的切入点，并为电针镇痛抗焦虑的临床应用提供新的思路和治疗策略。
第一部分腺苷受体参与电针治疗TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏炎症痛的外周机制
目的：
(1)采用TNBS诱导的炎症性肠病小鼠模型，研究电针对炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、体重、腹泻、结肠长度以及结肠组织SP和IL-1β蛋白表达水平的影响，确认电针的特异性消炎镇痛作用。
(2)研究电针对炎症性肠病小鼠外周结肠组织腺苷受体表达的调控作用，并在电针前进行腺苷A1、A2a、A2b、A3受体拮抗剂预处理，观察对电针消炎镇痛作用以及SP和IL-1β表达的影响，探讨外周腺苷受体参与电针缓解炎症性肠病小鼠内脏炎症痛的机制。
方法：
(1)造模：小鼠经单次肛门直肠给药方式,每只注射50μlTNBS(5%w/v)与50μl无水乙醇组成的混合溶液，建立TNBS诱导的炎症性肠病模型。
(2)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，电流1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，时间30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
(3)腺苷受体拮抗剂注射：在造模后1天，每次电针治疗之前30min，对TNBS+电针+拮抗剂组小鼠进行腺苷受体拮抗剂预处理。注射方式为每次电针前半小时腹腔注射，连续注射7天。A1受体拮抗剂DPCPX的剂量为3mg/kg，A2a受体拮抗剂ZM241385的剂量为1mg/kg，A2b受体拮抗剂PSB603的剂量为3mg/kg，A3受体拮抗剂MRS3777的剂量为5mg/kg。
(4)行为学检测：通过VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值；运用结直肠扩张(colorectal distension, CRD)实验记录腹部撤退反射(abdominal withdraw reflex score，AWRs)评分；每天记录体重、腹泻评分；取材前测小肠推进率，取材测量结肠长度；
(5)采用Westernblot方法测定结肠组织的A1、A2a、A2b、A3受体以及SP、IL-1β的蛋白表达水平。
结果:
(1)TNBS诱导的炎症性肠病小鼠出现了机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏、体重减轻、腹泻以及结肠长度缩短的症状。电针可显著缓解TNBS诱导的炎症性肠病小鼠的机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、体重减轻、腹泻和结肠长度缩短等症状。而假电针效果不明显。
(2)采用Westernblot方法测定结肠组织致痛因子SP和促炎因子IL-1β的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织的SP与IL-1β的表达显著增多。电针可明显下调小鼠结肠组织的SP和IL-1β的表达，而假电针则无显著效应。
(3)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A1受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A1受体的表达，而假电针组则无显著效应。A1受体拮抗剂DPCPX可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(4)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A2a受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A2a受体的表达，而假电针组则无显著效应。A2a受体拮抗剂ZM241385可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(5)TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织腺苷A3受体的表达显著减少。电针可以明显上调模型组小鼠结肠组织A3受体的表达。假电针组可轻度上调模型组小鼠结肠组织A3受体的表达，但仍低于电针组。A3受体拮抗剂MRS3777可明显减弱电针缓解机械痛觉超敏和下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
(6)TNBS诱导炎症性肠病组小鼠结肠组织腺苷A2b受体的表达显著增加。电针可以明显下调模型组小鼠结肠组织A2b受体的表达。假电针可轻度下调模型组小鼠结肠组织A2b受体的表达，但仍高于电针组。A2b受体拮抗剂PSB603对电针缓解机械痛觉超敏的作用无显著影响，但进一步增强了电针下调结肠组织SP与IL-1β表达的作用。
结论：
(1)电针可显著缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏和肠道炎症，并显著下调结肠组织致痛因子SP和促炎因子IL-1β的表达。证明电针具有特异性消炎镇痛作用。
(2)电针可上调TNBS诱导炎症性肠病小鼠结肠组织A1、A2a、A3受体的表达，下调A2b受体的表达。A1、A2a、A3受体的上调参与了电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠的消炎镇痛过程。A2b受体下调参与电针抑制内脏炎症反应的病理生理机制。
这些结果提示，电针通过上调外周A1、A2a、A3受体，下调A2b受体，抑制炎症因子SP和IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠内脏炎症痛。
第二部分腺苷A1和A2a受体参与电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的中枢机制
目的：
(1)研究电针对炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏、焦虑行为以及mPFC和vHPC的BDNF、IL-1β表达水平的影响，明确电针的中枢镇痛和抗焦虑作用。
(2)研究电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1、A2a受体表达水平的影响，并使用shRNA干扰mPFC和vHPC的A1和A2a受体表达，观察其对电针镇痛抗焦虑作用的影响，从而探讨中枢腺苷受体参与电针缓解炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的机制。
方法：
(1)痛感觉检测：VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值评价机械痛觉超敏；CRD实验记录AWRs评价内脏痛觉过敏。
(2)焦虑行为检测：旷场实验(open field test，OFT)、高架十字迷宫实验(elevated plus maze， EPM)。
(3)Westernblot技术检测小鼠mPFC和vHPC的A1受体、A2a受体、BDNF、IL-1β的表达水平。
(4)脑立体定位注射方法：在造模前三周，对溶媒+A1/A2aR空病毒组、模型+A1/A2aR空病毒组、模型+电针+A1/A2aR空病毒组、溶媒+A1/A2aRshRNA组、模型+A1/A2aRshRNA组、模型+电针+A1/A2aRshRNA组进行注射。注射剂量：每侧注射500nl/只(上海吉凯基因购买)。注射位置：双侧mPFC(AP：+2.5mm，ML：±0.4mm，DV：-2.5mm)，双侧vHPC(AP：-3.5mm，ML：±2.8mm，DV：-3.8mm)。注射时间约17min，注射速度30nl/min,留针约10min。共注射一次。
(5)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
结果：
(1)TNBS诱导的炎症性肠病小鼠出现了机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏，并伴有焦虑情绪。电针可显著缓解TNBS诱导的炎症性肠病小鼠的机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏和焦虑。而假电针则无明显效果。
(2)Westernblot方法测定mPFC和vHPC的抗焦虑因子BDNF、致痛因子IL-1β的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导的炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的BDNF表达明显减少，IL-1β表达明显增多。电针可显著上调mPFC和vHPC的BDNF表达，下调IL-1β受体表达。假电针则无明显影响。
(3)Westernblot方法测定mPFC和vHPC的A1、A2a受体的蛋白表达水平。结果显示，TNBS诱导的炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1受体表达明显减少，A2a受体表达明显增多；电针可显著上调mPFC和vHPC的A1受体表达，下调A2a受体表达。假电针则无明显影响。
(4)Westernblot方法检测A1RshRNA和A2aRshRNA的干扰效果。结果显示,分别注射了A1RshRNA和A2aRshRNA的mPFC中A1和A2a受体表达均明显减少。
(5)在mPFC注射A1受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏无明显影响，但减弱了电针改善焦虑的作用，并抑制了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用；在mPFC注射A2a受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏同样无明显影响，但增强了电针改善焦虑的作用，并增强了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用。
(6)在vHPC注射A1受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏无明显影响，但减弱了电针改善焦虑的作用，并抑制了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用；在vHPC注射A2a受体shRNA对电针改善机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏同样无明显影响，但增强了电针改善焦虑的作用，并增强了电针上调BDNF表达、下调IL-1β表达的作用。
结论：
(1)电针可显著缓解TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏症状以及焦虑情绪，并可上调mPFC和vHPC的抗焦虑因子BDNF表达，下调致痛因子IL-1β的表达。
(2)电针可上调TNBS诱导炎症性肠病小鼠mPFC和vHPC的A1受体表达，下调A2a受体的表达。干扰mPFC和vHPC的A1受体表达可减弱电针的抗焦虑以及调控BDNF、IL-1β的作用，干扰mPFC和vHPC的A2a受体表达可增强电针的上述作用。但干扰mPFC和vHPC的A1和A2a受体均对电针的缓解痛感觉作用无明显影响。
这些结果提示，电针通过上调中枢A1受体表达、下调中枢A2a受体表达，调控疼痛及焦虑相关因子BDNF和IL-1β的表达，从而改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的焦虑情绪。
第三部分腹侧海马至内侧前额叶皮质的投射在电针缓解TNBS诱导炎症性肠病痛感觉和痛情绪中的作用
目的：
(1)通过检测各脑区c-Fos的表达来探讨TNBS诱导炎症性肠病模型各脑区神经元激活情况以及电针治疗对激活脑区的影响。
(2)使用化学遗传技术检测腹侧海马至内侧前额叶皮质(vHPC-mPFC)的投射通路参与TNBS诱导炎症性肠病小鼠痛感觉和痛情绪的过程，以及对电针治疗作用的影响。
方法：
(1)痛感觉检测：VonFrey丝检测各组小鼠机械痛阈值评价机械痛觉超敏；CRD实验记录AWRs评价内脏痛觉过敏。
(2)焦虑行为检测：旷场实验(open field test，OFT)、高架十字迷宫实验(elevated plus maze， EPM)。
(3)免疫荧光技术：检测小鼠各脑区的c-Fos表达水平。
(4)化学遗传技术的病毒构建：基于Cre-DIO系统，在vHPC注射顺行DIO病毒rAAV-EF1α-dio-hM3Dq-mCherry-WPRE-pA或rAAV-EF1α-dio-hM4Di-mCherry-WPRE-pA；在mPFC注射逆行Cre病毒retro-rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA(AAV2/R)。hM3Dq兴奋病毒联合Cre重组酶病毒可以激活vHPC-mPFC投射通路；hM4Di抑制病毒联合Cre重组酶病毒可以抑制vHPC-mPFC投射通路。
(5)脑立体定位注射病毒方法：在造模前三周注射病毒。注射剂量：每侧200nl/只。注射位置：双侧mPFC(AP:+2.35mm，ML:±0.35mm，DV:-2.0mm)，双侧vHPC(AP:-2.9mm，ML:±2.5mm，DV:-4.0mm)。注射时间约7min，注射速度30nl/min,留针约10min。共注射一次。
(6)化学遗传操控：在行为学实验或电针治疗60min前向小鼠腹腔注射氯氮平(clozapine N-oxide，CNO)，用于激活hM3Dq或hM4Di。
(7)电针、假电针治疗：造模后第一天开始给予治疗。每天一次，连续7天。电针组毫针直刺双侧大肠俞(穴位BL25)约3mm，连接韩氏穴位神经刺激仪同一输出的2个电极，1mA，波宽0.3ms，频率2Hz，30min。假电针组浅刺皮下，留针30min，不进行提插捻转等手针刺激或电流刺激。
结果：
(1)TNBS诱导炎症性肠病可激活小鼠岛叶(insular cortex，IC)、中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)、前扣带回(anterior cingulate ， ACC)、第二运动皮层(supplementary motor cortex,M2)、丘脑室旁核(thalamic paraventricular nucleus，PVT)、海马(hippocampus, HPC)、内侧前额叶皮质(media prefrontal cortex, mPFC)脑区。电针可抑制TNBS诱导炎症性肠病小鼠IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC脑区神经元活性。
(2)抑制vHPC-mPFC通路可显著改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠的焦虑情绪、机械痛觉超敏和内脏痛觉过敏。
(3)激活vHPC-mPFC通路可拮抗电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠机械痛觉超敏、内脏痛觉过敏的作用，但对电针改善TNBS诱导炎症性肠病小鼠焦虑情绪的作用无显著影响。
结论：
(1)TNBS诱导炎症性肠病会激活小鼠的IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC和mPFC脑区，电针对IC、PAG、ACC、M2、PVT、HPC有调控作用。
(2)vHPC-mPFC下行投射通路参与TNBS诱导炎症性肠病小鼠的痛感觉和痛情绪的调节，并参与了电针对TNBS诱导炎症性肠病小鼠的镇痛过程。