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本研究以来源于Thermoanaerobacterium sp．strain JW/SL YS485中的木糖苷酶基因xylC为研究对象，将其从pxylo-2.2亚克隆至高效热激表达载体pHsh(由本实验室构建)上，得到质粒pHsh-xylC，并通过基因定点突变的方式实现了其在大肠杆菌中的高效表达，为其应用于工业生产奠定了基础。
本文结合DNA分析软件，分别通过以下5次突变：优化木糖苷酶基因xyICATG附近TIR区的mRNA二级结构使ATG从发夹结构的互补配对区中释放出来，进一步优化其mRNA二级结构使RBS也从发夹结构的互补配对区中释放出来，将紧接ATG后的第二密码子由原来的GAA改成AAA，将基因N端翻译起始区后的一段稀有密码子较集中的区域的稀有密码子改成大肠杆菌偏好性密码子，及在ATG下游第十五个碱基后面加上DB序列等，得到一系列的突变质粒pHsh-xyl Ⅰ、pHsh-xyl Ⅱ、pHsh-xyVlⅢ、pHsh-xylⅣ、pHsh-xyⅣ并将它们分别转入大肠杆菌JM109中进行诱导表达。重组菌pHsh-xyIC、pHsh-xyl Ⅰ、pHsh-xyl Ⅱ、pHsh-xylⅢ、pHsh-xylⅣ、pHsh-xylV每毫升菌液最高酶活分别达到1.35 U/ml、4.5 U/ml、3.012 U/ml、5.5 U/ml、5.49 U/ml、5.01 8 U/ml。重组菌pHsh-xylC的酶活是最初的重组菌pxylo-2.2的13.5倍。若以最初的重组菌pxylo-2.2和重组菌pHsh-xylC为参照，重组菌pHsh-xylⅢ的酶活是重组菌pxylo-2.2的55倍，是重组菌pHsh-xylC的4.07倍。SDS-PAGE密度扫描结果显示重组菌pHsh-xylⅢ的木糖苷酶表达量占总可溶性蛋白表达量的34％。这一结果显示ATG附近的mRNA二级结构及紧接ATG后的第二密码子的改变对基因表达的影响很大。
通过热处理、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、TOYOPEARLHW-55F分子筛层析及Butyl-HIC疏水层析等步骤对重组酶进行了提纯。纯化的木糖苷酶在SDS-PAGE胶上为单一电泳条带，从氨基酸序列所推测的蛋白分子量大小为72.6 kDa,这与SDS-PAGE胶上反映的分子量大小相吻合。所得纯酶的比酶活为62.9 U/mg蛋白，酶的纯化倍数为3.6倍，得率是21.6％。纯化结果显示可以用热处理的方式去除大量杂蛋白，使蛋白达到比较纯，且酶活收率达到95％，这一结果表明在今后的工业化应用过程中可以用热处理这种低成本而简便的方式制备该酶。另外，我们对重组木糖苷酶的酶学性质进行了研究，结果表明重组木糖苷酶的酶学性质与天然酶相似。重组酶只对pNPX有专一活性，其K<,m>值为28.4mM，K<,max>为275.8 U/mg。该酶对产物木糖有很高的耐受力，67 mM的D-木糖对酶活无影响，当木糖浓度高达200mM时仍有70％的酶活残留。酶的最适反应温度为65℃，最适反应pH值为6.0。在pH6.0，65℃条件下保温2h后残留酶活仍有87％。在pH 5.5～7.5之间酶的相对稳定性、残留活性都在80％以上。Ca<2+>、Na<+>、 Mg<2+>、K<+>和DTT对酶活无影响，但Hg<2+>和Ag<+>完全抑制酶活。50mM NaCl或KCI对酶活有一些促进作用，100 mM NaCl或KCl对酶活无影响，但更高浓度的NaCl或KCl能抑制酶活。该酶对底物和产物具有很高的耐受力，同时具有优良的热稳定性，是很有应用价值的一种工业酶。