一种组织特异性Connexin 31表达载体的构建

• 作 者: 朱怀虚
• 机 构: 中南大学
• 出 处: 中南大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 间隙连接蛋白 启动子 转基因模型 人CX31蛋白

背景：
间隙连接蛋白(Connexins)是一类可以在细胞的膜上组装成为间隙连接通道(Gap Junctions)以介导相邻细胞间小分子物质(<1000Da)的重要蛋白家族。通过这些物质和信息的交换，使得细胞间对外界刺激作出协调一致的反应。
Connexin31(CX31)是间隙连接蛋白家族的一员，其突变可导致显、隐性红皮肤角化病(dominant and/recessive EKV)，显、隐性神经性耳聋(dominantand/recessive hearing impairment)，或者显性神经性耳聋-周围神经病(dominanthearing impairment combined with peripheral neuropathy)等。CX31的基因敲除小鼠中没有发现耳聋或皮肤病的表型，以人CX31蛋白为启动子的转基因小鼠研究发现其F137L突变体小鼠表皮可出现部分角质化。CX31对于细胞稳态维持、细胞增殖、分化具有重要作用。但对CX31通道组装、通道通透性、通道功能调节和细胞内运输等CX31分子特征和细胞行为的认识还很粗略。
目的：
增强CX31在细胞中的表达水平，尤其是突变体在某一特定组织中的表达水平，将有可能使动物模型出现相应的表型。本研究用Keratin14蛋白启动子构建CX31野生型和F137L突变体的表达载体，并研究该载体的皮肤组织表达能力和表达特异性。得到一种可望用于转基因动物模型的皮肤组织特异性表达的CX31载体。
方法：
我们使用PCR技术，将CX31产物连接到，含有Keratin14启动子、兔globin和Keratin14的3’非翻译区的载体中。然后将该载体用Lipifectamine LTX转染Hacat细胞，应用免疫沉淀和免疫荧光技术对CX31的表达进行检测。为了研究其组织表达的特异性，我们还用磷酸钙法转染了HEK293T细胞，并用免疫荧光技术对CX31的表达情况进行了检测。
结论：
本研究构建的CX31组织特异性表达载体能有效表达，在线性化去除其部分骨架后可望用于转基因动物模型的构建。