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目的:白细胞介素-18(interleukin-18 IL-18)是一种新型的细胞因子,可以诱导T细胞、NK细胞产生干扰素-γ,促进T细胞增殖、增强细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的活性,具有抗肿瘤和免疫调节等多种功能。本实验应用分子生物学的方法克隆人IL-18(human interleukin-18 hIL-18)基因,构建人IL-18真核表达质粒并转染人卵巢癌HO-8910细胞,观察hIL-18基因能否在人卵巢癌HO-8910细胞内表达。初步探讨hIL-18对卵巢癌细胞生长增殖活性的影响,为制备卵巢癌基因工程肿瘤疫苗奠定实验基础。方法:根据Genbank登录的IL-18序列用DNAstar软件设计上下游引物,利用逆转录--聚合酶链反应(RT-PCR)技术从胎盘组织中克隆人IL-18基因,经鉴定正确后,与pGEM-T载体连接,构建pGEM-hIL-18质粒。pGEM-hIL-18质粒经酶切鉴定,测序分析后转化至大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆于LB液体培养基,37℃过夜培养,提取质粒。重新设计引物,在上下游引物中分别引入SalI和EcoRI酶切位为点,以pGEM-hIL-18为模板进行PCR,PCR产物和pCI-neo真核表达载体分别进行双酶切,构建pCI-hIL-18重组质粒。常规培养卵巢癌HO-8910细胞,将鉴定正确的pCI-hIL-18重组质粒用Lofectamine2000介导法将人IL-18基因转导人卵巢癌细胞系HO-8910中,转染分三组:空白组:卵巢癌HO-8910细胞株+脂质体;对照组:卵巢癌HO-8910细胞株+pCI:实验组:卵巢癌HO-8910细胞株+pCI-hIL-18。用一定剂量的药物筛选阳性克隆,挑取阳性克隆进行扩大培养。分别抽提三组转染细胞的RNA用上述引物进行RT-PCR检测,用ELISA方法检测细胞培养上清液IL-18蛋白表达;用MTT法检测转染pCI-hIL-18重组质粒的卵巢癌HO-8910细胞生长增殖能力的变化。结果:1.成功从人胎盘组织内克隆出IL-18基因,大小为605bp,包含有IL-18完整的ORF,经测序分析与Genbank登录(登录号NM 001562)的IL-18序列完全一致。2.成功构建重组克隆质粒pGEM-hIL-18和真核表达质粒pCI-hIL-18。3.重组表达质粒pCI-hIL-18经脂质体转染至卵巢癌细胞,用RT-PCR和ELISA检测分别在mRNA水平和蛋白水平获得表达。空白组和对照组均未检测到IL-18的表达。4.转染pCI-hIL-18重组质粒的卵巢癌HO-8910细胞生长增殖能力降低。结论:1.人IL-18基因可以从胎盘组织成功克隆1.人IL-18基因可以在转染的卵巢癌HO-8910细胞细内表达2.转染人IL-18基因的卵巢癌HO-8910细胞生长增殖活性降低