【摘 要】
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目的：构建携带人NRP-1的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒表达载体并筛选出高效的NRP-1/shRNA干扰序列，初步探讨RNAi(RNAinterference，RNAi)沉默NRP-1基因对乳腺癌细
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目的：构建携带人NRP-1的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒表达载体并筛选出高效的NRP-1/shRNA干扰序列，初步探讨RNAi(RNAinterference，RNAi)沉默NRP-1基因对乳腺癌细胞的生物学行为的影响。 方法：1.设计并合成3对靶向人NRP-1的特异性干扰序列和1对非特异性对照序列，分别亚克隆至慢病毒载体pLB中，通过PCR及测序进行鉴定;2.Westernblot技术鉴定高表达NRP-1的乳腺癌细胞株;3.分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞，生产慢病毒颗粒，并依据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达水平检测病毒滴度;慢病毒颗粒感染细胞后，用流式细胞仪筛选出GFP阳性细胞;4.实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测NRP-1的表达，并筛选出沉默效率最高的干扰序列;5.CCK-8法及AV-PI法结合流式细胞仪(FCM)检测RNA干扰NRP-1基因对细胞增殖、凋亡的影响;6.CCK-8法检测EPI对MCF-7、SK-BR-3细胞的生长抑制情况及AV-pI法结合流式细胞仪(FCM)检测EPI诱导后各组细胞的凋亡情况。 结果：1.经PCR及测序结果证实，成功构建了pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒，重组慢病毒滴度达108 IU/mL;2.Western blot结果显示:MCF-7及SK-BR-3细胞高表达NRP-1蛋白;3.重组慢病毒颗粒感染后，MCF-7细胞及SK-BR-3细胞特异性干扰组(pLB-NRP-1/shRNA3) NRP-1 mRNA和蛋白表达量均明显低于对照组;4.CCK-8法结果显示:MCF-7细胞及SK-BR-3细胞NRP-1/shRNA组于48 h、72 h、96 h的OD值均低于相应对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)，而阴性对照组和空白对照组无明显差异(P＞0.05);AV-PI法结合流式细胞仪检测凋亡率显示:MCF-7细胞及SK-BR-3细胞NRP-1干扰组的凋亡率均高于相应对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照无明显差异(P＞0.05);5.CCK-8法结果示:EPI在浓度0-10.0μg/mL时，随浓度的升高，抑制作用增强;MCF-7细胞的IC50为2μg/mL，而SK-BR-3细胞的IC50为1.5μg/mL; EPI作用于细胞后，MCF-7细胞和SK-BR-3细胞干扰组的凋亡率均较对照组增加(P＜0.05)。 结论：成功构建了编码人NRP-1基因的慢病毒表达载体，并筛选出高效的NRP-1/shRNA干扰序列。且RNAi沉默NRP-1基因后可抑制乳腺癌细胞增殖，促进其凋亡，提高其药物敏感性。
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