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摘 要：目的：建立维生素B12滴眼液中维生素B12有关物质的检测方法。方法：高效液相色谱法，乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（17：83），用磷酸调节PH值至3.0。检测波长361nm。结果：本方法能有效检测出维生素B12的有关物质。
关键词：维生素B12 有关物质 HPLC
维生素B12滴眼液是适用于眼疲劳等眼部不适症状，依据《中华人民共和国药典》2000版2002年增补本70页收载的萘朴维滴眼液，并参考了《中华人民共和国药典》2005版644页收载的维生素B12滴眼液的相关标准。
1.仪器及试剂：
高效液相色谱仪：Agillen 1100
试剂：乙腈为色谱醇；磷酸二氢钾为分析醇；水为二次蒸馏水。
样品：本公司生产，批号为040901、040902、040903。
对照样品：山东正大福瑞达药业有限公司。 、维生素B12有关物质的测定
制剂原质量标准中无维生素B12的有关物质检查项，维生素B12原料有关物质的测定方法为HPLC法，所以拟采用此色谱条件测定B12的有关物质。
2.色谱条件
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（17：83），用磷酸调节PH值至3.0；检测波长：361nm；
3.方法与结果
3.1检测波长的确定：取维生素B12对照品和维生素B12阴性液、01批样品加水制成每1ml含20μl的溶液，在200～400nm波长处进行扫描，在200nm～300nm之间三种溶液均有最大吸收，但在361nm处维生素B12对照品和成品有最大吸收，故选在361nm处测定样品中维生素B12的有关物质。
3.2专属性试验
对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥4小时的维生素B12对照品25mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml量瓶中，摇匀，即得。
样品溶液的制备：称取本品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录谱图。
结果表明：对照品在该色谱条件下有峰出现，并且峰形较好，保留时间适中；在对照品有峰出现的位置，供试品也有峰出现，并且主峰与杂质峰完全分开。5.2 阴性干扰试验：取阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液，精密吸取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照溶液色谱中无吸收峰，阴性不干扰维生素B12的测定，
3.3 破坏试验
酸破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加2mol/l盐酸2ml，室温放置2小时，加2mol/L 氢氧化钠溶液中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加2mol/l氢氧化钠溶液2ml，室温放置2小时，加2mol/L 盐酸中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
氧破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加入30% H2O2 2ml，室温放置2小时，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
热破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，于105℃烘箱中放置2小时，取出，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
光破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，于7000Lux条件下放置2小时，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：取以上供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果表明：样品经酸、碱、氧、热、光破坏后，产生的杂质峰能与维生素B12主峰完全分开。
结论：经专属性试验可知，该色谱条件测定样品中维生素B12的专属性良好，因此确定以该色谱条件测定样品中维生素B12的有关物质。
4 测限的确定：取维生素B12对照品溶液，用流动相进行一系列的稀释，精密吸取稀释液各20ul注入液相色谱仪，测得本品中维生素B12的检测限为5ng。
5.溶液稳定性试验 精密吸取样品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，放置，分别于第0、2、4、6、8小时照样品有关物质方法测定，以峰面积计算RSD值。结论：峰面积的平均值为1065.72，RSD为0.56%，小于2.0%，说明本品的水溶液在8小时内稳定性良好。见表1
表1溶液稳定性试验结果
6. 有关物质限度的制订：
精密吸取样品（批号：01、02、03、04、05、06）各5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密吸取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主峰峰高约为满量程的10～25%。精密吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的二倍，供试品溶液如显杂质峰，计算各杂质峰峰面积之和及有关物质。结果见表2
表2维生素B12滴眼液维生素B12有关物质限度制订测定结果
结果：测定六批样品中有关物质均小于1.0%，因此规定本品中有关物质限度为1.0%。
7. 测定方法的确定
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷鍵合硅胶为填充剂，以乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（17：83）用磷酸调节PH值至3.0为流动相，检测波长361nm，理论板数按维生素B12峰计算不低于2000。
测定法：取本品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密吸取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主峰峰高约为满量程的10-25%。再精密吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的二倍，供试品溶液如显杂质峰，计算各杂质峰面积之和，不得大于维生素B12主峰面积的0.5倍（1.0%） 。
8. 样品中维生素B12有关物质的测定
对试制的本品三批样品及对照样品依法测定有关物质，测定三批样品及对照样品有关物质均小于1.0%，均符合规定。结果见表3。
表3 维生素B12有关物质检查结果
参考文献
《中华人民共和国药典》2000版2002年增补本70页收载的萘朴维滴眼液
《中华人民共和国药典》2005版644页收载的维生素B12滴眼液的相关标准
关键词：维生素B12 有关物质 HPLC
维生素B12滴眼液是适用于眼疲劳等眼部不适症状，依据《中华人民共和国药典》2000版2002年增补本70页收载的萘朴维滴眼液，并参考了《中华人民共和国药典》2005版644页收载的维生素B12滴眼液的相关标准。
1.仪器及试剂：
高效液相色谱仪：Agillen 1100
试剂：乙腈为色谱醇；磷酸二氢钾为分析醇；水为二次蒸馏水。
样品：本公司生产，批号为040901、040902、040903。
对照样品：山东正大福瑞达药业有限公司。 、维生素B12有关物质的测定
制剂原质量标准中无维生素B12的有关物质检查项，维生素B12原料有关物质的测定方法为HPLC法，所以拟采用此色谱条件测定B12的有关物质。
2.色谱条件
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（17：83），用磷酸调节PH值至3.0；检测波长：361nm；
3.方法与结果
3.1检测波长的确定：取维生素B12对照品和维生素B12阴性液、01批样品加水制成每1ml含20μl的溶液，在200～400nm波长处进行扫描，在200nm～300nm之间三种溶液均有最大吸收，但在361nm处维生素B12对照品和成品有最大吸收，故选在361nm处测定样品中维生素B12的有关物质。
3.2专属性试验
对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥4小时的维生素B12对照品25mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml量瓶中，摇匀，即得。
样品溶液的制备：称取本品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录谱图。
结果表明：对照品在该色谱条件下有峰出现，并且峰形较好，保留时间适中；在对照品有峰出现的位置，供试品也有峰出现，并且主峰与杂质峰完全分开。5.2 阴性干扰试验：取阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液，精密吸取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照溶液色谱中无吸收峰，阴性不干扰维生素B12的测定，
3.3 破坏试验
酸破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加2mol/l盐酸2ml，室温放置2小时，加2mol/L 氢氧化钠溶液中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加2mol/l氢氧化钠溶液2ml，室温放置2小时，加2mol/L 盐酸中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
氧破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，加入30% H2O2 2ml，室温放置2小时，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
热破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，于105℃烘箱中放置2小时，取出，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
光破坏：取本品5ml，置10ml量瓶中，于7000Lux条件下放置2小时，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：取以上供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果表明：样品经酸、碱、氧、热、光破坏后，产生的杂质峰能与维生素B12主峰完全分开。
结论：经专属性试验可知，该色谱条件测定样品中维生素B12的专属性良好，因此确定以该色谱条件测定样品中维生素B12的有关物质。
4 测限的确定：取维生素B12对照品溶液，用流动相进行一系列的稀释，精密吸取稀释液各20ul注入液相色谱仪，测得本品中维生素B12的检测限为5ng。
5.溶液稳定性试验 精密吸取样品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，放置，分别于第0、2、4、6、8小时照样品有关物质方法测定，以峰面积计算RSD值。结论：峰面积的平均值为1065.72，RSD为0.56%，小于2.0%，说明本品的水溶液在8小时内稳定性良好。见表1
表1溶液稳定性试验结果
6. 有关物质限度的制订：
精密吸取样品（批号：01、02、03、04、05、06）各5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密吸取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主峰峰高约为满量程的10～25%。精密吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的二倍，供试品溶液如显杂质峰，计算各杂质峰峰面积之和及有关物质。结果见表2
表2维生素B12滴眼液维生素B12有关物质限度制订测定结果
结果：测定六批样品中有关物质均小于1.0%，因此规定本品中有关物质限度为1.0%。
7. 测定方法的确定
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷鍵合硅胶为填充剂，以乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（17：83）用磷酸调节PH值至3.0为流动相，检测波长361nm，理论板数按维生素B12峰计算不低于2000。
测定法：取本品5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密吸取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主峰峰高约为满量程的10-25%。再精密吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的二倍，供试品溶液如显杂质峰，计算各杂质峰面积之和，不得大于维生素B12主峰面积的0.5倍（1.0%） 。
8. 样品中维生素B12有关物质的测定
对试制的本品三批样品及对照样品依法测定有关物质，测定三批样品及对照样品有关物质均小于1.0%，均符合规定。结果见表3。
表3 维生素B12有关物质检查结果
参考文献
《中华人民共和国药典》2000版2002年增补本70页收载的萘朴维滴眼液
《中华人民共和国药典》2005版644页收载的维生素B12滴眼液的相关标准