【摘 要】
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从一株具有氯苯降解能力的邻单胞菌中克隆到一个新的邻苯二酚1,2-双加氧酶(tfdC),通过序列分析表明,该基因拥有一个765bp的开放阅读框,编码255个氨基酸,与增氧产碱中tfdC基因
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从一株具有氯苯降解能力的邻单胞菌中克隆到一个新的邻苯二酚1,2-双加氧酶(tfdC),通过序列分析表明,该基因拥有一个765bp的开放阅读框,编码255个氨基酸,与增氧产碱中tfdC基因具有高度的同源性.将该基因的翻译起始密码子由GTG定点突变成ATG后,构建到原核表达载体pBluescriptⅡKS上,通过大肠杆菌表达,证明该基因产物具有邻苯二酚降解活性,而且起始密码子的突变不影响酶活性.通过试验,证明pET-30a是该基因表达的较为合适的载体,将起始密码子为ATG的目的基因构建到pET-30a,筛选到正确的重组pET30A,导入到大肠杆菌BL21中研究其表达,SDS-PAGE检测到预期的条带,酶活性比用pKS载体时高5倍以上.邻苯二酚1,2-双加氧酶是芳香族有机污染物降解的关键基因,为了获得具有污染物修复能力的植物材料,将起始密码子为ATG的tfdC基因构建到农杆菌双元载体pPZPY122中,电转化农杆菌,获得了菌株LBA4404/pPZPY122/tfdC,通过该农杆菌介导拟南芥转化,筛选到了阳性植株.利用PCR方法对阳性植株进行筛选,并进一步用PCR-Southern和Southerndotblot方法对转化子进行验证,结果证明,tfdC基因已经整合到植物的基因组中,酶活性检测表明,转基因植物材料中具有开苯环的酶活性,而对照植物则较低.
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