【摘 要】
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目前国内外还没有对绿豆过敏原检测方法的报道,但其对敏感人群的致敏危害严重。因此建立一种简单、快速的绿豆过敏原酶联免疫检测方法具有重要的现实意义。本论文通过实验研
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目前国内外还没有对绿豆过敏原检测方法的报道,但其对敏感人群的致敏危害严重。因此建立一种简单、快速的绿豆过敏原酶联免疫检测方法具有重要的现实意义。本论文通过实验研究建立了绿豆过敏原的酶联免疫检测方法。首先从绿豆中提取绿豆蛋白,通过SDS-PAGE分析得到主要的绿豆蛋白分子量50,38,34和25kDa,用考马斯亮蓝G-250法对得到的蛋白定量。通过免疫BALB/c小鼠建立绿豆蛋白致敏模型,得到效价最高的一组为用弗氏佐剂,经皮下注射,并且第4次免疫14天后采全血组的抗血清,效价达1：64000。免疫新西兰大耳白兔,获得效价达1：32000的绿豆蛋白多克隆抗血清。采用免疫印迹法分析鼠抗绿豆蛋白抗血清和兔抗绿豆蛋白抗血清的亲和性,得到两种抗血清与蛋白在50和25kDa有强的结合。与九种蛋白的交叉反应结果显示,抗体的特异性较高。然后通过对免疫分析条件的优化,建立了灵敏的双抗体夹心酶联免疫检测方法。包被捕获抗体0.5μg/well,0.5%脱脂乳粉作为封闭液,从5u g/mL开始2倍梯度稀释绿豆蛋白,用PBS1：20000倍稀释检测抗体,HRP标记羊抗鼠二抗1：10000倍稀释,室温显色20min。此法具有较高的灵敏度,检测限为4.99ng/mL。准确度高,样品加标回收率为80.35%-88.41%。且稳定性好,板内变异1.58%-3.78%,板间变异3.14%-6.41%。进一步考察了热加工过程对食品过敏原结构稳定性的影响。在干热加工条件下,绿豆蛋白和绿豆粉的热加工相比较可以看出,随着温度的升高,蛋白的热加工造成的过敏原变化剧烈。在湿热加工条件下,绿豆蛋白的抗原稳定性变化不大,而蛋白溶液的抗原稳定性明显下降。
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