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神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是婴幼儿最常见的恶性肿瘤,儿童期最常见的颅外实体肿瘤。随着诊疗技术的进步,低危组和中危组NB患者生存率可达80-90%;但NB异质性强,疾病复杂性、难治性同时存在,故高危组NB患者长期无进展生存率(Progression-free survival)仍不足40%。靶向治疗因其具有特异性杀伤肿瘤细胞的优势近年在抗肿瘤新药研发中迅速发展,但在儿童肿瘤治疗中应用有限;由于NB的发病机制尚不完全明确,因此,进一步探索、阐述NB的发病机制并探索新的治疗靶点对于NB治疗以及提高患者生存率具有重要的指导意义。Polo-like kinase 4(PLK4),Polo蛋白激酶家族成员之一,中心粒复制重要调控因子,其蛋白含量异常可见于肝癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中,但具体机制尚不完全明确。本课题旨在检测PLK4在NB组织中的蛋白及mRNA表达情况,结合临床数据分析其表达水平与NB患者临床病理特征以及生存预后的关系,然后通过一系列体外、体内实验进一步探索PLK4在NB发生、发展中的作用机制。研究方法:1.组织实验:PLK4在NB患者组织中表达分析收集有关PLK4生物信息,利用芯片探索PLK4表达与NB患者生存率之间的关系;采集7对经病理证实的NB肿瘤组织及其相关正常组织,用Western blot及RT-PCR技术检测组织中PLK4的蛋白及mRNA含量。2.验证PLK4表达与NB患者临床病理特征及生存预后分析的关系通过免疫组化方法检测PLK4在85例NB患者肿瘤标本中表达情况,利用SPSS22.0统计学软件分析PLK4表达水平与NB患者临床病理特点及生存预后的相关性。3.体外实验:检测PLK4对NB细胞生物学行为的影响(1)通过构建PLK4降表达、过表达质粒,利用慢病毒感染的方法,建立PLK4稳定降表达、过表达细胞系和相应对照组细胞系;(2)利用细胞功能学实验(平板克隆、MTT、流式细胞周期、凋亡实验及Transwell、划痕实验)验证PLK4对NB细胞系增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响;(3)利用Western blot及Immunofluorescence技术检测PLK4降表达的NB细胞系中,上皮间质转化(EMT,Epithelial-mesenchymal Transition)相关标记物及其转录因子表达水平的变化;结合NB组织及细胞系中p-Akt表达水平探讨PI3K/Akt通路在调控PLK4介导的EMT在NB发生、发展中的作用。4.体内实验分别用PLK4降表达的NB细胞系及对照组细胞系于裸鼠腹股沟行小鼠成瘤实验,6周后处死小鼠,取出肿瘤,测量肿瘤实际大小和重量,检测肿瘤组织中PLK4、增殖、凋亡、EMT等指标的表达水平并观察肿瘤转移情况。结果:1.利用生物信息学软件,初步检测到PLK4 mRNA低表达患者生存率明显高于高表达患者(P值均小于0.001),推测PLK4表达水平与患者预后呈负相关;在NB患者的肿瘤样本中检测到PLK4蛋白及mRNA表达水平均高于相应正常组织。2.PLK4的表达强度与NB患者原发部位(c2=4.093,P=0.038)、初诊时血清LDH水平(c2=29.181,P<0.001)、治疗后是否复发(c2=7.280,P=0.006)以及INSS分期(c2=5.270,P=0.019)密切相关。而且,PLK4强表达与Ki-67表达水平呈正相关性,与患者3年总体生存率(OS,c2=12.485,P<0.001)及无进展生存率(PFS,c2=10.616,P=0.001)呈现显著的负相关。但PLK4的表达水平与患者年龄、性别、N-myc扩增状态、骨髓转移等无明显相关性(P>0.05)。3.与对照组细胞系相比,NB细胞系经PLK4降表达后,细胞增殖、侵袭、迁移能力减弱,凋亡比例增高;同时E-cadherin表达水平升高,N-cadherin、vimentin、Slug等指标表达水平下调,Akt表达水平稳定,p-Akt表达水平下调。免疫组化发现NB组织以及利用Akt酶抑制剂LY294002干扰过表达组NB细胞系可知p-Akt表达水平与PLK4表达水平呈显著相关性。4.与PLK4对照组细胞系相比,注射PLK4降表达的NB细胞系的小鼠成瘤能力下降,两组小鼠肿瘤体积及重量、增殖、凋亡等指标均存在明显差异。结论:1.在NB组织中,PLK4蛋白及mRNA表达水平上调,PLK4高表达与NB患者生存率呈显著负相关性,提示PLK4是NB的促癌因子。2.体内、体外实验证实,PLK4促进NB细胞侵袭和迁移,抑制凋亡。3.PLK4通过PI3K/Akt通路调控EMT促进NB发生、发展。