【摘 要】
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牛结核病(Bovinetuberculosis)主要是由牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性传染病。参考GenBank中MPT83基因序列，设计合成了一对含酶切位点的引物，从牛分
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牛结核病(Bovinetuberculosis)主要是由牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性传染病。参考GenBank中MPT83基因序列，设计合成了一对含酶切位点的引物，从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA，PCR扩增出MPT83基因，克隆进pMD18-TSimpleVector，将测序正确的目的基因亚克隆入表达载体pET-32a(+)中，转化BL21(DE3)宿主菌，构建出重组表达质粒pET-MPT83，PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定表明构建正确。IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量42ku左右处出现新的蛋白条带，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导起始时间为3h，诱导4h后表达量即达到高峰。Western-Blot分析表明，融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别，具有良好的反应原性。表达蛋白可用作基因工程诊断抗原。
收集诱导表达的菌液，超声破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE，结果证明表达产物主要以包涵体形式存在。亲和层析方法纯化表达蛋白，取少量纯化产物进行SDS-PAGE，结果在42ku处出现清晰单一的特异性蛋白条带，表明表达产物的纯化良好。
用纯化的牛分支杆菌重组MPT83蛋白作为包被抗原，建立了检测牛分支杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件为：抗原包被浓度为1μg/mL，二抗稀释倍数为1600倍，血清稀释倍数为60倍，抗原和血清、血清和二抗都是在37℃条件下反应30min，底物在37℃显色15min，阴阳性临界值定为：D655nm=0.5。通过阻断试验、交叉试验、重复性试验表明该方法特异性强、重复性好。这为进一步组装成诊断试剂盒奠定了物质基础，为牛结核病的诊断与检测提供了一种良好的技术手段。用建立的间接ELISA方法对18份结核菌素试验阳性牛的血清和36份结核菌素试验阴性牛的血清进行了检测，结果表明阳性血清的符合率为27.7％，阴性血清的符合率为91.7％。
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