【摘 要】
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在实验室的前期工作中构建、表达了CaM-mut-proinsulin融合基因,用阴离子交换层析纯化CaM-mut-proinsulin融合蛋白,再经PreScission Protease切割,利用凝胶层析获得mutant pr
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在实验室的前期工作中构建、表达了CaM-mut-proinsulin融合基因,用阴离子交换层析纯化CaM-mut-proinsulin融合蛋白,再经PreScission Protease切割,利用凝胶层析获得mutant proinsulin单体蛋白。但是单体蛋白损失大,得率低。鉴于亲和层析的高特异性与高产量,同时重组亲和标签不能对蛋白质本身结构与功能造成较大影响,构建了CaM-mut-proinsulin蛋白C端添加6×His标签的重组蛋白质突变体分子。基于镍柱亲和纯化方法,较好地纯化制备了CaM-mut-proinsulin.6xHis融合蛋白以及mut-proinsulin-6×His单体蛋白,目标蛋白的纯化效率较以前方案有一定程度的提高。通过对两者的性质研究,发现两者均会抑制ADP诱导的血小板聚集;通过测定凝血四项还发现CaM-mut-proinsulin-6×His蛋白只是参与了初级凝血的过程,并不参与次级凝血过程。此外对胰岛素原突变体KGD两侧区域再次进行突变,构建胰岛素原突变体RRKGD和KGDRR,并进行突变体蛋白的表达纯化与制备。测定其抗血小板聚集活性,以进一步研究KGD序列前后的两个精氨酸序列对胰岛素原突变体抗栓活性的影响。Δ
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