论文部分内容阅读
钙依赖性蛋白激酶(CPKs)是一类在植物体内广泛分布的重要调控因子。水稻基因组中有31个CPK基因被鉴定出来。该家族的不同基因在水稻的不同组织及发育的不同时期表达模式不同。前期的实验结果发现,OsCPK21基因在水稻生殖器官中特异表达,特别是在花粉成熟后期和颖果发育后期高表达。通过原位杂交的实验结果发现,OsCPK21在花粉成熟前的空泡期开始表达。因此推测,OsCPK21在水稻的生殖发育过程中扮演着非常重要的角色,其表达受到水稻发育的时间和空间的精细调控。 为了研究OsCPK21在水稻颖果发育过程中的表达调控机制,以日本晴(Oryzasativa L.japonica.CM.Nipponbare)的基因组为模板,克隆了OsCPK27基因起始密码子ATG上游2181 bp的启动子序列(POsCPK21)。利用http://www.dma.affrc.go.jp/PLACE网站进行POsCPK21的相关调控元件预测。结果表明,POsCPK21上分布有干旱、ABA和糖相关的响应元件。此外,利用"TFSEARCH"工具查找到POsCPK21上分布着Myb类转录因子的结合位点。这表明,POsCPK21可能参与非生物胁迫的调控。根据生物信息学预测的结果构建了5端截断的启动子POsCPK21(-1/2181)、POsCPK21(-1/-1286)、POsCPK21(-1/-538)、POsCPK21(-1/-396)和POsCPK21(-1/236)连接报告基因荧光素酶的植物表达载体。即待测启动子连接萤火虫荧光素酶报告基因串联内参CaMV35S启动子连接海参萤光素酶报告基因(POsCPK21::Fluc-CaMV35S::Rluc)的植物表达载体。利用基因枪转化方法将不同载体转化到水稻愈伤组织中,潮霉素B抗性筛选获得水稻转基因愈伤组织。并使用Promega公司提供的DuaI-Luciferase(R)Reporter Assay System检测POsCPK21的活性。检测结果显示,POsCPK21(-1/-2181)在水稻悬浮细胞中能够驱动报告基因高表达,其活性是植物转化实验中最常用的CaMV35S启动子活性的62倍。且POsCPK21的活性区主要集中在ATG上游至-538 bp。对含有全长启动子POsCPK21(-1/-2181)的水稻悬浮细胞进行植物激素ABA、GA3、NAA、JA和糖饥饿和糖处理。结果表明,50μM和100μM的ABA都能够诱导启动子的活性增加,而且100μM的ABA处理能够使启动子活性增加2-3倍,且ABA的作用表现为剂量和时间依赖的效应。而50μM的GA3和NAA均抑制该启动子活性。50μM的JA对其无影响。利用糖饥饿处理含POsCPK21(-1/2181)的水稻悬浮细胞可以使荧光素酶活性增加2倍,加葡萄糖、果糖和蔗糖时活性又降低至原来的水平,而加甘露糖和甘露醇时活性不改变。其次,还发现,POsCPK21的活性不随渗透压的改变而变化,因此可以确定POsCPK21受糖调控的主要原因是由于培养基中碳源的改变引起的,而与培养基中渗透压的变化没有关系。更重要的是,发现POsCPK21(-1/-538)既不受ABA处理的影响,也不受糖处理的影响,这表明POsCPK21上ABA和糖相关的调控元件集中在-538上游。 因此,本项研究表明,PosCPK21是一水稻悬浮细胞内高表达的启动子,并且其活性受激素与糖的调控,推测可能参与水稻花及颖果发育的调控过程,这对进一步探究OsCPK21参与水稻颖果发育的调控分子网络机制提供科学依据,对研究水稻花药及早期颖果发育有着重要的科学意义。