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表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）的过度表达和不恰当激活被认为与多种肿瘤的发生发展密切相关，尤其在头颈部肿瘤中EGFR表达上调最普遍，约占80％-100％。关于喉癌组织EGFR表达的研究在国内外文献中已有较多记录。大部分研究报道喉癌组织中EGFR过度表达，但是也有报道EGFR在癌组织和癌旁正常组织中表达无明显差异。以往的研究大多采用免疫组织化学染色或RT-PCR半定量技术，这些方法在定量方面仍有缺陷，不同的研究结论很可能是由于喉癌组织EGFR表达水平的定量研究仍缺乏准确客观的方法的缘故。TagMan探针逆转录—实时荧光定量PCR技术是用于mRNA扩增定量检测的一项新技术，与RT-PCR半定量分析、Northern印迹法等传统mRNA定量方法相比，具有特异性高、稳定性好和高通量等优点。本研究运用该技术测定喉癌及癌旁组织学正常的喉黏膜组织中EGFR mRNA的表达水平，探讨其应用价值。材料和方法1组织标本收集2003年6月至2005年9月在浙江大学医学院附属第二医院耳鼻咽喉科住院手术的部分喉癌病例的切除组织标本。共32例，均为男性，年龄40-73岁，中位年龄为57.5岁。病理诊断均为鳞状细胞癌，包括低分化4例，中分化19例，高分化9例。根据国际抗癌协会（UICC）和美国癌症联合会（AJCC）TNM分类标准（2002）第六版：Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期7例。所有病例均为初发患者，术前未接受放化疗。从手术切除标本中切取小块癌组织和癌旁阴性切缘以外的喉黏膜组织，置于预先高压灭菌的的冻存管中，立即置于液氮中并保存于—80℃冰箱。2方法以Primer Express Software v2.0软件设计EGFR的引物探针。构建重组pGEM—T Easy／EGFR质粒，测序鉴定后将质粒按10倍浓度梯度稀释成标准品。所有组织样本以Trizol法提取组织中总RNA，常规方法逆转录，合成cDNA，将组织样本cDNA和按10倍浓度梯度稀释的质粒DNA pGEM-T Easy／EGFR标准品（104copies/ul—107 copies/ul）以及阴性对照（ddH2O）在实时荧光定量PCR检测系统2.0版上以最佳PCR条件进行EGFR检测，同时以GAPDH为内参照。3数据分析以相对定量法计算EGFR mRNA含量，EGFR mRNA的相对含量=2-ΔCT（ΔCT=EGFR的CT值-GAPDH的CT值）。所得数据以SPSS 12.0统计软件包进行处理，经正态性检验，数据呈偏态分布，故结果用中位数（四分位数间距），即M（QR）表示。以Wilcoxon秩和检验进行差异显著性检验。结果重组pGEM—T Easy／EGFR质粒经测序鉴定，与Genbank中的EGFR序列进行比对，与预期完全一致。应用TagMan探针实时荧光定量PCR技术测定EGFR mRNA含量的方法构建成功。喉癌组织中EGFR mRNA相对含量中位数为0.025，其四分位数间距为0.076；癌旁组织学正常喉黏膜的EGFR mRNA相对含量中位数为0.008，其四分位数间距为0.027（P＜0.01）。结论1．喉癌组织EGFR mRNA含量较癌旁组织学正常喉黏膜组织明显增高，mRNA水平的扩增可能是喉癌组织EGFR上调表达的一个重要原因。2．TagMan探针逆转录—实时荧光定量PCR技术可作为一种喉癌组织中EGFR mRNA水平定量测定的新方法，具有更客观、准确、高通量等优点。