论文部分内容阅读
农业虫害是农作物减产的一个重要因素,虫生真菌是自然界中昆虫种群数量调控的重要因子之一。不同于昆虫病原细菌和病毒,虫生真菌通过昆虫体壁进行主动入侵,因此,除了具有害虫持续控制效果外,虫生真菌对于蚜虫、粉虱等刺吸式口器的害虫具有明显的防治优势。
子囊菌类金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae,下简称绿僵菌)作为虫生真菌,其寄主范围可达50科、200余种昆虫。绿僵菌具有典型的真菌侵染过程:分生孢子附着于昆虫体表,孢子萌发并分化形成附着胞,借助各种降解酶的联合作用而穿透昆虫体壁,体内形成虫菌体而快速繁殖,由于营养剥夺及分泌毒素等作用而杀死害虫。绿僵菌具有病原真菌致病的典型性,已经成为虫生真菌分子致病机理和真菌一昆虫互作研究的理想模式系统。但是由于存在击倒害虫时间较长、对环境条件要求高及防治效果不稳定等缺点,包括绿僵菌在内的真菌杀虫剂的广泛应用受到了很大的限制。因此,有必要加强虫生真菌致病过程的分子机理研究,鉴定毒力相关的主效基因并揭示其功能。
本研究克隆了金龟子绿僵菌电杀虫毒力相关基因mpk1,分析了其进化来源,通过基因敲除的方法分析了它们在绿僵菌致病性及其它相关过程的作用；对绿僵菌脂被蛋白MPL1基因进化及其磷酸化位点突变进行了研究；克隆了另一个毒力相关基因MaBI-1,并对其进行了的初步研究。具体研究结果如下:
1.克隆了一个金龟子绿僵菌磷酸解酮酶基因mpk1,该基因在绿僵菌侵染至昆虫血淋巴后高度表达。系统进化研究表明绿僵菌mpk1为从细菌获得的水平转移基因,在真菌进化树中的分布不均匀,存在“获得-丢失”(gain-loss)现象。同源替换的基因功能研究表明,mpk1缺失影响绿僵菌对海藻糖的利用。说明MPK1介导的糖代谢途径在植物-昆虫-真菌的三级营养关系中,对于真菌利用昆虫血淋巴中的糖类物质发挥着重要的作用。与野生型相比,mpk1基因缺失突变株对烟草天蛾的毒力显著下降,表明mpk1为毒力基因。
2.克隆测序了不同绿僵菌菌种或菌株的mpl1基因,并对各个菌种/株孢子的脂滴含量进行了统计,基因进化分析表明,mpl1的基因型决定了孢子脂滴含量,而与绿僵菌种化关系不明显。采用点突变的方式将mpl1基因中编码保守的Lys-L,ys-Pro-Thr(AAGAAGCCCACC)磷酸化位点苏氨酸密码子(ACC)分别突变为类似哺乳动物PerA的磷酸化位点丝氨酸Ser(AGC)和不可磷酸化位点异亮氨酸Ile(ArC)。将野生型及突变型的mpl1基因转化到缺失突变株Δmpl1中。同时将另一胞内脂滴含量多的977菌株的mpl1基因转入Δmpl1中进行基因替换。脂滴特异性荧光染料BODIPY493/503染色表明,分生孢子中各磷酸化位点突变菌株脂滴含量差异不大,但在营养贫乏的培养基中诱导培养后,突变成异亮氨酸(Ile)的转化子脂滴转运受到影响。经western blotting验证,突变成异亮氨酸(Ile)的MPL1不能被磷酸化,生物测定表明,磷酸化位点突变后(Thr→Ile)影响了真菌的杀虫毒力。基因替换能够增加菌株的脂滴含量及提高受体菌的杀虫毒力。
3.克隆了金龟子绿僵菌中一个细胞凋亡抑制因子(Bax inhibitor1),命名为MaBI-1,并对其进行了初步的功能分析。该基因为真菌中首次报道的BI-1家族基因,GFP融合蛋白分析表明,同哺乳动物及植物的BI-1一样,MaBI-1也定位于内质网。使用酵母细胞进行功能验证发现,凋亡抑制蛋白Bcl-2能很好地抑制由Bax引起的酵母细胞凋亡,MaBI-1也能部分抑制由Bax引起的酵母细胞凋亡。当将模式植物拟南芥的细胞凋亡抑制因子AtBI-1转到含有Bax的酵母里却不能很好地抑制其凋亡作用,这与前人的研究结果有所不同。MaBI-1基因敲除突变子在正常培养条件下,表型上与突变子差异不大,但在基本培养基MM上,突变子菌落形态与野生型有明显差异,回补后菌落形态又恢复到了野生型状态。生物测定表明突变子杀虫毒力明显下降,表明该基因是个毒力基因。