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鱼类等低等脊椎动物也存在类似哺乳动物干扰素(Interferon,IFN)系统相关基因。现已知斑马鱼(Daniorerio)有17个这类同源基因(Dre),排序从A到Q,分别称为DreA...DreI...DreQ,其中DreI与鲫鱼IFN系统基因CaGig2[GCHVinducedgene2fromCruciancarp(CarassiusauratusL.)]同源性最高。因而本论文针对DreI的信号通路和抗病毒功能等开展研究,主要结果如下:
1.DreI的克隆、结构及表达模式:设计特异引物,经PCR扩增DreI。对DreI的开放读框(Openreadingframe,ORF)进行序列和二级结构分析,预测这是能够编码一个蛋白质含158个氨基酸、未见已知结构域的基因。将所扩增的DreI全长cDNA连接到pMD18-T克隆载体中,转化DH5α菌株,原核表达并提纯原核表达产物后免疫家兔,制备兔抗DreI血清。进一步通过Westernblot和Real-timePCR,检测在受到PolyI:C刺激的斑马鱼肝脏细胞ZFL(zebrafishlivercells)中,DreI的mRNA转录水平与蛋白表达水平,结果它们均出现上调表达,这表明DreI的确是斑马鱼IFN系统基因。
2.DreI的启动子的结构及作用:将DreI启动子中一段218bp并且含有ISRE和GAS序列的片段克隆至载体pGL3-Basic上,利用启动子-报告基因的方法来检测DreI启动子活性。结果显示,PolyI:C,rIFN(recombinantIFN)和SVCV(springviremiaofcarpvirus)均能够诱导DreI启动子的活性上调。为了验证DreI启动子中ISRE序列的保守性,将ISRE位点中的GA突变成CT后,DreI启动子活性大大降低,说明DreI肩动子中ISRE序列对其功能是不可或缺的。
3.DreI的信号通路:利用鲫鱼三种RLR[Retinoicacid-induciblegeneI(RIG-I)-likereceptors]系统蛋白质粒:CaRIG-I,CaMDA5(melanomaifferentiation-associatedgene5)和CaIRF3(interferonregulatoryfactor3),对DreI启动子进行刺激后,发现均能诱导其活性上调,表明DreI是一个受RLR家族蛋白调控的基因。IRF3被认为是RLR信号通路中的一个关键因子,当在该体系中加入CaIRF3-DN(DominantnegativemutantofCaIRF3)后,无论是外源免疫源刺激还是内源过表达,DreI启动子的活性都被抑制。因此,DreI受到CaRIG-I和CaMDA5通过CaIRF3来调控。
4.DreI的抗病毒功能鉴定:利用免疫荧光技术,发现DreI蛋白在细胞质中特异表达。在鲤上皮瘤细胞系(Epitheliomapapulosumcyprinid,EPC)中,在感染本别属于DNA和RNA病毒的RGV(Ranagryliovirus)和SVCV后,转染DreI与转染空质粒的相比,能明显降低病毒复制并且保护细胞。
以上结果表明,DreI是一个具有保守ISRE位点,受RLR信号通路调控并且具有抗病毒功能的基因。