绿僵菌和玫烟色拟青霉分子系统发育及其毒理学研究

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在农作物害虫的生物防治方面虫生真菌是有效的防治手段之一。本文利用RAPD,SSR标记和ITS—rDNA技术,研究不同寄主和不同地区绿僵菌菌株的系统进化关系;对采自不同地区的玫烟色拟青霉菌株进行种内遗传变异研究;检测从玫烟色拟青霉中所提取的粗毒素蛋白对小菜蛾的杀虫和拒食活性;筛选绿僵菌毒素的高产菌株,评估不同绿僵菌菌株的绿僵菌素产量,并测定绿僵菌素对菜粉蝶的毒性。研究结果如下: ⑴利用SSR和RAPD标记检测不同绿僵菌菌株的种内变异。绿僵菌是对鳞翅目害虫有防治潜力的一种生物防治因子。本文利用SSR和RAPD标记研究来自不同寄主和不同地理区域的绿僵菌菌株的种内变异。运用SSR标记研究结果表明,每个分子标记平均有5.4个等位基因片段,其中雄性个体和多态信息容量指数分别为0.37和0.63。利用RAPD引物扩增后发现,每个引物平均可扩增出7.4条带,其中10个引物中的5条可以扩增出49.5%的多态性带,表明其提供的信息是可靠的。SSR和RAPD对不同地理来源菌株的分子差异分析显示,所有菌株之间的遗传差异分别为80.65%和85.65%。固着指数(Fst)分别为0.197和0.152,显示在所研究的绿僵菌株系中的遗传差异非常小。SSR和RAPD标记的研究结果表明,虽然不同来源的绿僵菌遗传变化很小,但还是可以说明它们之间的进化关系。 ⑵不同绿僵菌菌株的系统进化分析和遗传距离分析。对来自亚洲(中国、老挝、新加坡、南朝鲜)和欧洲(荷兰)绿僵菌株株的流行和遗传距离的研究表明,绿僵菌在中国,特别是华南和华西南地区的农田和森林土壤中分布比较广泛。分离出的40个地理菌株中,绿僵菌的检出率最高,达81.6%,荷兰的土壤样品中绿僵菌的检出率也较高,而在老挝的地壤样品中,只是在森林土壤中有大量绿僵菌被检出。ITS—rDNA序列分析结果表明,所收集的不同地理区域的绿僵菌菌株在进化上非常相近,不同寄主上的绿僵菌菌株的亲缘亲系也比较相近,大多数的分离株属于亲缘关系较近的基因型,其遗传距离为0.23-0.34%,并且主要分布在农业和森林生态系统中。而来自老挝的菌株LSNM1和其它地理菌株在分子进化上不属于同一分支,表现出的遗传差异最大,为0.34%。饱和度分析结果表明在碱基组成和漂移上很强的偏好性导致了在基因迁移过程中出现某些过饱和现象。 ⑶不同生态系统拟青霉菌株的系统进化分析。利用ITS1,ITS2和5.8S rDNA序列对来自森林、农田和城市郊区等不同生境的拟青霉菌株的系统进化关系进行了研究。研究肉座菌目中玫烟色拟青霉、马昆德拟青霉、淡紫拟青霉菌和红树林拟青霉四个亚簇的ITS基因,结果表明这四个菌株显示出遗传分化的一致性。其中玫烟色拟青霉的一个菌株与其它菌株明显不同,与马昆德拟青霉,淡紫拟青霉菌和红树林拟青霉等菌株的关系久远。另外研究了拟青霉不同菌株的遗传变异性,并与来自其它国家的菌株的多态性分布进行比较,表明拟青霉不同株系中大多数属亲缘关系较近的基因型。研究发现在法国和美国株系中遗传距离最大,为0.169%。 ⑷玫烟色拟青霉粗毒素蛋白对菜粉蝶的杀虫和拒食活性。从察氏培养液的上清液提取粗毒素蛋白,以小菜蛾3龄幼虫为生测对象,测定了粗毒素蛋白的杀虫和拒食活性。研究结果表明,在所有供试菌株中,CNZH菌株的粗毒素蛋白对小菜蛾的杀虫和拒食活性最高。粗毒素蛋白表现出较强的时间一剂量效应,当浓度为9mg/mL时,处理后第6天小菜蛾幼虫的死亡率最高,为83.3%;粗毒素蛋白对小菜蛾幼虫的拒食活性随着粗毒素蛋白浓度的增加、处理时间的延长而增强。 ⑸绿僵菌毒素蛋白对菜青虫的生物测定及毒素蛋白的高量菌株筛选。以菜青虫为生测对象,对绿僵菌素的毒力进行了生物测定,从不同株系的绿僵菌中筛选出绿僵素的高产菌株,并对毒素蛋白的培养条件进行了探索。LSHY菌株对菜青虫的毒力最强,死亡率高达87.5%。从LSHY菌株中提取的绿僵菌素A(DA)和B(DB)对菜青虫48小时的LC50值分别为421.09(355.45—498.86)和373.18(291.24—428.18),在浓度为600mg/L时的LT50值分别为37.72(22.54—63.10)和47.55(12.24—184.70),结果表明DA比DB的毒力强。在液体培养条件下,绿僵菌在接种后的第3天便可产生绿僵素A和B,而在固体培养条件下没有绿僵菌素产生;在液体培养条件下,LSHY菌株在第15天时绿僵素的产量最高,为25.6mg/L,LSVT2菌株在第18天的产量最高,为13.5mg/L。
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