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溶藻弧菌是我国南方海水养殖动物的重要病原菌,目前许多学者对溶藻弧菌的毒力因子进行了研究,找出致病因子和主要毒力基因是阐明致病机理的关键。本文围绕溶藻弧菌的致病机理进行了以下研究:
(1)溶藻弧菌普通溶血现象及相关基因探索。本文用普通TSB兔血平板考察47株溶藻弧菌环境株的溶血能力,有22株出现α溶血,1株出现β溶血,溶血率为48.94％。另外溶血影响因子实验发现培养基的pH值和铁离子浓度对溶藻弧菌溶血有明显影响。用PCR扩增和克隆测序的方法研究溶藻弧菌的溶血素基因(vah),发现在溶血和不溶血菌株中vah基因分布情况一致,基因编码序列也没有差别。但是在影响基因表达强度的上游启动子部分,溶血菌株的启动子中UP元件区第188-190个碱基均为CCG或TCG,不溶血菌株的UP元件区第188-190个碱基均为TAA。这暗示了溶藻弧菌普通溶血能力的差异很有可能与vah基因启动子区UP元件密切相关。
(2)溶藻弧菌神奈川现象(KP)的存在及其相关基因分析。用我妻氏兔血平板检测了133株溶藻弧菌环境株,其中25株有KP现象(KP+),KP阳性率为18.8％。但在所有KP+菌株中都没有检测出副溶血弧菌中与KP现象相关联的tdh和trh基因。用RAPD方法我们在KP+菌株中找到一条特异性条带,经克隆测序证实为高度类似于弧菌株Ex25假定的钙依赖性外膜样蛋白(PCMP)基因,该基因与RTX毒素基因高度相关。据此分别设计引物RTX-F2/R2检测弧菌株Ex25或副溶血弧菌的PCMP,引物RTX-F3/R3检测溶藻弧菌、副溶血弧菌或弧菌株Ex25的RTX毒素基因在溶藻弧菌中的分布是否与溶藻弧菌KP现象存在某种联系。结果显示同时存在PCMP和RTX毒素的溶藻弧菌神奈川实验显示为溶血；PCMP和RTX毒素同时不存在的溶藻弧菌神奈川实验显示为不溶血；只存在PCMP或RTX毒素之一的溶藻弧菌除2株外均溶血,但溶血圈较小,以上结果显示出PCMP和RTX毒素很有可能与溶藻弧菌的KP现象有关联。此外,通过生物信息学分析显示,PCMP和RTX毒素也可能是与副溶血弧菌KP现象相关联的因子。
(3)溶藻弧菌质粒分离及全序列分析。我们培养了一株溶藻弧菌E259,从中分离出一个质粒pVAE259,使用酶切、克隆测序的方法获得pVAE259的全序列,利用软件分析其分子生物学特征并探索该质粒可能具备的功能。结果显示pVAE259为闭合环状质粒,全长6,075 bp,GC含量为42.16％。在NCBI中比对发现pVAE259与Vibrio sp.41隐蔽性质粒pPS41具有较高的相似性。我们在序列中找到一个oriT位点,另外全序列的4118-5494 bp推测为质粒复制区域。pVAE259中存在7个氨基酸序列长度大于100的开放式阅读框(ORF):ORF1-ORF7。其中ORF1编码蛋白属于释放酶超级家族(Relaxase Super-family)蛋白；ORF2编码蛋白属于复制酶超级家族(Replicase Super-family)蛋白；ORF5与伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)质粒pHE1的转移蛋白MobC相似。根据上述结果及相关文献分析,pVAE259可能是具有转移能力的质粒,该质粒是否影响宿主菌的表型性状还不清楚。
通过对溶藻弧菌两种溶血现象相关基因及质粒全序列的分析,渴望找到新的与溶藻弧菌毒力相关的基因,为从分子水平揭示溶藻弧菌的致病机理做出贡献。