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棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae)属鳞翅目夜蛾科害虫,广泛分布在南纬40°至北纬40°之间。棉铃虫食性杂,寄主包括棉花、玉米、小麦、蔬菜等多种农作物,在亚洲、大洋洲、非洲和欧洲均有为害报道。在防治棉铃虫的过程中,大量使用杀虫剂,世界各地相继报道棉铃虫对有机磷类、氨基甲酸酯类及拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗性。在棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性机理中,大量研究集中于细胞色素P450介导的氧化解毒代谢。在棉铃虫对有机磷的抗性机理中,解毒代谢增强及乙酰胆碱酯酶敏感性下降的相对作用还不清楚。有关酯酶在棉铃虫对拟除虫菊酯及有机磷抗性中的作用还缺乏深入研究。
本文通过对抗性品系中活性升高的酯酶同工酶进行分离纯化及质谱鉴定,系统研究了酯酶在棉铃虫氰戊菊酯抗性中的作用。结果表明棉铃虫氰戊菊酯抗性涉及到多个CCE001家族基因,且抗性品系中CCE001家族酯酶基因在解毒代谢组织中的过量表达与棉铃虫氰戊菊酯抗性相关。酯酶在棉铃虫对久效磷的抗性中也起着重要作用。具体研究结果如下:
1.棉铃虫氰戊菊酯抗性相关酯酶同工酶的分离纯化及对氰戊菊酯的离体水解
棉铃虫氰戊菊酯抗性品系YGF3龄幼虫的酯酶活性是敏感品系SCD的1.9倍,同时在YGF品系中存在更多具有高酯酶活性的个体。YGF品系与SCD品系酯酶Native PAGE图谱也有差异,特别是迁移率为0.4和0.35两个区域的酯酶同工酶(以下命名为A组和B组)显现出染色强度的显著不同。在YGF品系中A组酯酶的染色强度是SCD品系的4.9倍,B组是SCD品系的12.7倍。YGF品系中这两组酯酶同工酶都能水解氰戊菊酯类似物,但在SCD品系的相同区域几乎没有染色反应。A组及B组酯酶活性升高可能与棉铃虫对氰戊菊酯的抗性有关。
利用离心、硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析及离子交换层析技术对YGF品系中A组和B组酯酶同工酶进行分离纯化。A组酯酶纯化倍数达50倍,回收率为0.13％。A组酯酶的纯化产物在酯酶Native-PAGE上显现为一条主要的同工酶带,在SDS-PAGE上显现为一条主要蛋白带,分子量约为60kDa。这是真核生物典型的单聚体羧酸/胆碱酯酶分子。纯化后的A组及B组酯酶均可离体水解氰戊菊酯,A组酯酶水解氰戊菊酯更迅速。
2.棉铃虫氰戊菊酯抗性相关酯酶同工酶的质谱鉴定及基因克隆
通过液质联用鉴定出A组酯酶蛋白含有四种同工酶,分别为CCE001a、-d、-i和j,其中CCE001a在A组酯酶中蛋白丰度最高。在YGF和SCD品系中扩增了CCE001a,-d,-i和-j基因的全长cDNA,四个酯酶基因由碱基序列推导的氨基酸序列都含有维持酯酶功能的催化三联体及氧阴离子洞,属于羧酸酯酶。四个酯酶基因编码的氨基酸序列在YGF及SCD品系间都存在一些差异,这些差异可能是氨基酸多态性而与棉铃虫菊酯抗性无关。
3.棉铃虫氰戊菊酯抗性和敏感品系CCE001家族酯酶基因转录水平的比较
采用实时定量PCR技术检测YGF和SCD品系中CCE001a,-d,-i和-j的转录水平。四个CCE001家族酯酶基因在YGF品系中肠及脂肪体中的转录水平均高于SCD品系,特别是丰度最高的CCE001a酯酶,其在脂肪体中的转录水平是敏感品系的90倍。抗性品系YGF中CCE001家族酯酶基因在解毒代谢组织中的过量表达与YGF品系对氰戊菊酯的抗性有关。
4.酯酶在棉铃虫久效磷抗性中的作用
相对SCD敏感品系,室内筛选的棉铃虫久效磷抗性品系AYR对久效磷的抗性达到137倍。DEF对久效磷的增效作用达到27倍,PBO及DEM没有明显增效作用。AYR品系中非特异性酯酶的活力是SCD敏感品系的1.4倍,且差异达到显著水平。两品系间多功能氧化酶及谷胱甘肽S-转移酶活性差异不显著。因此,酯酶活性升高可能是棉铃虫AYR品系对久效磷产生抗性的主要机理。
5.棉铃虫久效磷抗性和敏感品系乙酰胆碱酯酶生化特性及基因克隆
在AYR和SCD品系中,久效磷对乙酰胆碱酯酶的抑制中浓度(Ⅰ50)分别是0.011和0.007 mg·ml-1(差异不显著)；抗性品系和敏感品系间乙酰胆碱酯酶酶动力学参数Km和Vmax也无显著差异。利用鳞翅目昆虫ace1基因某些结构域的保守性设计简并引物,扩增到棉铃虫acel基因全长cDNA。棉铃虫acel基因含有2085bp开放阅读框,编码695氨基酸残基。同时在前人研究的基础上扩增了棉铃虫的ace2基因。从棉铃虫ace1和ace2基因的全长推导其氨基酸序列,两个ace基因在抗性和敏感品系间均有一些氨基酸差异。由于这些差异出现的频率及所处的位点,推断其可能是氨基酸多态性而与抗性无关。因此,棉铃虫AYR品系对久效磷抗性与乙酰胆碱酯酶敏感性关系不大。