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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率就全球而言仍然在不断上升，全世界每年以2﹪的速度增长，我国上海也以4.2﹪的速度增长，可见结直肠癌严重威胁着人类的健康。
结直肠癌根治术后治疗失败主要原因是在于肿瘤的转移。肝脏是结直肠癌最常见的转移部位。而且肝脏常是其惟一转移的脏器，无肝转移的肝外转移则罕见。随着分子生物学的深入研究，发现肿瘤转移的每一步骤都和微血管形成密切相关。试验证实，实体瘤只有具备了血管形成后力能恶性生长和发生成功的转移。转移肿瘤细胞必须建立有自己的血管网络从而打破宿主的内在微环境的平衡，而且，在肿瘤转移这个动态连续过程中，微血管的生成贯彻了这一过程的始终。使用血管抑制剂可明显抑制肿瘤的生长。微血管的形成是肿瘤侵袭和转移的关键。
因此，抗微血管的形成为探索恶性疾病治疗的新靶点。抑制肿瘤细胞合成和释放VEGF，或阻断其受体表达有可能显著抑制肿瘤的生长和转移。维甲酸(retmoicacM，RA)又称视黄酸或维生素A酸，是维生素A的衍生物。其中最重要的是全反式维甲酸(ATRA)。与其它类固醇激素一样，机体内一定浓度的维甲酸可调节细胞的增殖、分化、成熟、免疫及毒性物质的转化，是机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要因子。维甲酸还可诱导白血病细胞株(HL-60)细胞或原代培养的急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞向成熟分化，并已成为治疗APL的经典药物。在宫颈癌、皮肤鳞状细胞癌的病人使用维甲酸能达到很好的疗效。新近的实验研究和临床观察表明，维甲酸还有抑制VEGF、下调微血管密度的作用。本课题的目的是研究全反式维甲酸(ATRA)对人结直肠癌LoVo细胞株表达VEGF和其受体的影响，为全反式维甲酸治疗结直肠癌提供理论依据。
方法与结果
一：应用ELISA法检测LoVo细胞分泌VEGF的情况：
实验方法：将培养至80﹪融合的LoVo细胞消化制成单细胞悬液，细胞计数调节细胞浓度至1×10<6>/ml，按每孔0.1ml(1×10<5>)接种于A、B、C3个6孔板上；每板分为5组：空白对照组(不含全反式维甲酸或无水乙醇)、<-5> mol/L全反式维甲酸组、10<-6>mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组、10<-2>mol/L无水乙醇组。并作3个相应的复板。
常规培养至指数生长期时，空白对照组加以同等量的RPMI-1640继续培养，实验组(10<-5>mol/L全反式维甲酸组、10<-6>mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组、10<-2>mol/L无水乙醇组)分别换用含相应浓度药物的RPMI-1640的溶液进行培养。取不同药物不同时间作用的5*10<6>个细胞，培养体系为5ml，于37℃、5﹪CO<,2>饱和湿度的培养箱中培养48h，然后2000r/min离心8～10min，收集培养上清液，然后进行Elisa实验，检查上清液中VEGF含量，按照试剂盒测试步骤进行。每个细胞上清液样本皆行正副2个测试孔，最后取平均OD值。然后酶联仪检测450nm波长的吸光度值(OD值)，结果输入SPSS11.0 for windows软件，应用随机区组设计的方差分析(Tow way ANOVA)对数据进行处理，并绘制不同浓度全反式维甲酸作用于LoVo细胞24h、48h、72h细胞VEGF表达的图形。
结果：
(1) 本组中无水乙醇组对LoVo细胞VEGF分泌的影响与对照组无统计学差异(p>0.05)。可以认为本实验组所使用的全反式维甲酸溶剂——无水乙醇对LoVo细胞VEGF分泌无明显影响。10<-5>mol/L全反式维甲酸组、10<-6>mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组与空白组差异有统计学意义(p<0.05)。10<-5>mol/L全反式维甲酸组、10<-5> mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组两两比较差异有统计学意义(p<0.05)。
(2)各组在不同浓度全反式维甲酸作用24小时、48小时、72小时各时段两两比较VEGF表达差异具有统计学意义(p<0.05)。
(3)不同浓度全反式维甲酸作用于LoVo细胞不同时段的VEGF表达抑制图形显示，全反式维甲酸对人结直肠癌LoVo细胞VEGF表达的抑制率呈明显的时间、浓度依赖性。0.01mmol/L全反式维甲酸作用于结直肠癌LoVo细胞72小时后抑制率可达到62.19﹪。
结论：全反式维甲酸可抑制人结直肠癌LoVo细胞VEGF分泌表达，并呈一定的时间和浓度依赖性。表达的抑制率呈明显的时间、浓度依赖性。
二、流式细胞术检测分析不同浓度全反式维甲酸作用于Lovo细胞后VEGF受体变化情况：
实验方法：将培养至80﹪融合的LoVo细胞消化制成单细胞悬液，细胞计数调节细胞浓度至1×10<6>/ml，按每孔0.1 ml(1×10<5>)接种于A、B、C3个6孔板上；每板分为5组：空白对照组、10<-5>mol/L全反式维甲酸组、10<-6>mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组。并作3个相应的复板。
常规培养至指数生长期时，空白对照组加以同等量的RPMI-1640继续培养，实验组(10<-5>mol/L全反式维甲酸组、10<-6>mol/L全反式维甲酸组、10<-7>mol/L全反式维甲酸组)分别换用含相应浓度全反式维甲酸的RPMI-1640进行培养。每间隔24小时收集细胞，消化并制备单细胞悬液，然后用PBS液洗三次，调整细胞浓度至每毫升中含4<*>10<6>个悬浮细胞，加入人的IgG/10<5>，封闭Fc受体，分别加入单克隆PE(藻红蛋白)标记抗人VEGF R1，VEGF R2，VEGF R3流式抗体各10μl(0.5mg/ml)，置于2～8°C 30～45分钟。上机进行流式细胞仪检测VEGF R。并将数据输入SPSS11.0 for Windows系统，应用随机区组设计的方差分析(Tow Way ANOVA)对数据进行处理，并绘制不同浓度全反式维甲酸作用于Logo细胞24h、48h、72h细胞VEGF受体表达的图形。结果：
(1) 人结直肠癌Lovo细胞株有VEGF受体的表达，提示结直肠癌存在自分泌作用系统。
(2) 0.0001mmol/LATRA作用24、48小时对VEGF R1抑制作用与空白组相比，差别无统计学意义(P值>0.05)。0.0001mmol/L ATRA作用72小时和0.001mmol/L ATRA、0.01mmol/L ATRA作用3个时间段与空白组差异有显著性(p<0.05)，0.0001mmol/L ATRA组、0.001mmol/L ATRA组、0.01mmol/LATRA组之间两两比较也有显著性差异(p<0.05)。各组在不同浓度全反式维甲酸作用24小时、48小时、72小时各时段两两比较有显著性差异(p<0.05)。
(3) 0.0001mmol/L ATRA作用24、48小时及0.001mmol/L ATRA作用24小时对VEGF R2抑制作用与空白组相比，差别无统计学意义(P值>0.05)。0.001mmoI/L ATRA作用72小时、0.001mmol/L ATRA组作用48、72小时以及0.01mmol/L ATRA组作用24、48、72小时与空白组差异有显著性(p<0.05)，0.0001mmol/L ATRA组、0.001mmol/L ATRA组、0.01mmol/L ATRA组两两相比也有显著性差异(p<0.05)。各组在不同浓度全反式维甲酸作用24小时、48小时、72小时各时段两两比较有显著性差异(p<0.05)。
(4) 对VEGF R3而言，0.0001mmol/LATRA、0.001mmol/L ATRA组、0.01mmol/LATRA 组与空白组差异有显著性(p<0.05)，0.0001mmol/L ATRA组、0.001mmol/L ATRA组、0.01mmol/L ATRA组两两相比较也有显著性差异(p<0.05)。各组在不同浓度全反式维甲酸作用24小时、48小时、72小时各时段两两比较有显著性差异(p<0.05)。
(5) 0.01mmol/L全反式维甲酸作用于结直肠癌LoVo细胞72小时后Rl表达抑制率可达到89.91﹪；R2表达抑制率可达到90.36﹪；R3表达抑制率可达到90.32﹪。
结论：全反式维甲酸可抑制结直肠癌LoVo细胞VEGF受体表达，并呈一定的时间和浓度依赖性。表达的抑制率呈明显的时间、浓度依赖性。
全文结论：
(1) 人结直肠癌Lovo细胞株不仅表达VEGF，同时也表达VEGF受体，提示VEGF可以自分泌途径发挥作用。
(2) 全反式维甲酸可抑制VEGF的分泌，并呈一定的时间和浓度依赖性。VEGF分泌的抑制率随药物浓度的增大和作用时间的延长而增高。
(3) 全反式维甲酸可抑制VEGF受体(R1、R2、R3)的表达，并呈一定的时间和浓度依赖性。VEGF受体的表达的抑制率随药物浓度的增大和作用时间的延长而增高。
(4) ATRA能够抑制VEGF和VEGF受体表达，阻止二者结合，破坏VEGF/VEGFR自分泌系统。因而，推断ATRA能够遏制结直肠癌生长和转移。