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心脏是脊椎动物器官发生过程中最早形成并且最先具有功能的的器官之一。心脏发育是一个极其复杂和精确的过程,受一系列心脏发育基因在时间和空间上的精确调控。当胚胎期的心脏发育基因的表达或者功能异常时,会导致严重的先天性疾病甚至早期胚胎死亡。研究调控心脏发育候选基因的功能及其作用的分子机制,使人们从分子水平认识心脏发育和先天性心脏病发生的机制,为以后的出生干预以及早期发现和治疗先天性心脏病提供很好的理论基础。本文以斑马鱼作为模式动物研究了 Pygo1基因在心脏发育、Pygo1基因的母源性效应以及fhlA基因在调控心脏发育和骨骼肌发育中的作用。人类Pygo1定位于染色体15q21.1,生物信息学分析表明该基因cDNA全长1260bp,有2个内含子,3个外显子。Pygo1基因所编码的蛋白在N端有一个C6H5的PHD锌指蛋白结构域,属于锌指蛋白家族,该基因在无脊椎动物、脊椎动物以及人类中高度保守,序列结构高度同源。目前的研究表明它是经典Wnt信号途径的新成员。本人利用斑马鱼作为模式动物,研究斑马鱼Pygo1基因在胚胎发育中的功能。首先通过原位杂交技术对斑马鱼Pygo1的表达进行了研究,并且以地高辛标记的senseRNA探针作为阴性对照,原位杂交实验结果表明在胚胎发育到5-8体节的时候,Pygo1在库氏泡(Kupffer’s vesicle)特异表达,在胚胎发育到15-18体节的时候,Pygo1在心脏的前体细胞区域-侧板中胚层特异表达,在22体节的时候只在心脏表达;在25体节的时候特异性表达于胚胎的神经脊中(心脏神经嵴细胞能迁移进入胚胎心脏,参与主肺动脉隔、流出道心内膜垫的形成与流出道的分隔),到24小时阶段在心管中特异表达。Pygo1基因这种特殊的表达模式提示其可能与左右不对称发育有关,同时也和心脏发育有关。利用Tg:NPPA以及Tg(cmlc2::dsRed2-nuc)转基因斑马鱼的胚胎为材料,注射Pygo1 Morphoinos后发现,斑马鱼的心脏环化出现紊乱,同时,将Pygo1 Morphoinos注射到野生型(AB品系)斑马鱼胚胎中,利用地高辛标记的nppa anti-sense RNA为探针,原位杂交实验同样证明Pygo1能够调控野生型斑马鱼心脏左右不对称发育。我们又追踪心脏的早期发育过程,bmp4以及myl7原位杂交实验结果显示Pygo1影响斑马鱼心脏前体细胞的迁移过程,导致心脏前体细胞迁移出现紊乱;进一步用左右不对称发育标志基因(如spaw、leftyl、lefty2等)进行检测,证明Pygo1能够调控左右不对称发育标志基因的表达,当过表达Pygo1以及敲减Pygo1的时候都能使左右不对称发育标志基因表达发生紊乱,将Pygo1 mRNA与Pygo1 Morpholinos共同注射到斑马鱼胚胎以后,能够拯救突变表型,进一步说明Pygo1能够调控左右不对称发育;之后用脊索的标志基因shh进行原位杂交实验,实验结果表明Pygo1基因能够调控脊索的发育,并且能够通过调控脊索的形成调控左右不对称发育的;双色原位杂交实验表明Pygo1和Nodal信号途径的关键调控因子Charon在库氏泡(Kupffer’s Vesicle)共同表达,通过Morpholinos敲低技术与加帽mRNA过表达技术研究发现,在Pygo1过表达以及敲减Charon的时候都能够导致左右不对称发育紊乱、微管蛋白的动态组装异常、出现两个类似库氏泡的结构,该结果提示Pygo1可能和Charon拮抗地调控左右不对称发育,最后通过体内Co-IP实验证明Pygo1能够直接与Charon相互作用,并且通过抑制Charon调控库氏泡的发育;该研究表明Pygo1可能是连接Wnt信号途径与Nodal信号途径的一个关键“结点”,在它们之间起着重要的交互作用(cross-talk)。原位杂交实验表明Pygol有母源性表达,为了研究其母源性的功能,构建了 Tg(Cmlc2:EGFP-Pygo1)以及Tg(Hsp70-4:EGFP-Pygo1)的转基因斑马鱼品系,同时,将Pygo1 MO注射到未受精的卵细胞中,注射后再进行人工受精,发现无论是过表达Pygol还是敲低母源性的Pygo1,斑马鱼在发育早期的有丝分裂过程中都出现紊乱。本人研究的另外一个基因为fhlA,斑马鱼fhlA是人类FHL1的同源基因,是four and a half LIM domain家族的成员之一,包含4个半LIM结构域,人类FHL1基因的mRNA通过选择性剪切编码FHL1,SLIMMER以及KyoT2蛋白,这三个异构体都与肌肉发育有关。首先,克隆了斑马鱼fhlA以基因的ORF,将目的片段连接到pGEMT载体中,合成地高辛标记的anti-sense RNA,进行原位杂交实验,结果表明fhlA从128-512细胞期,fhlA在细胞核中特异表达,从胚胎发育8-20体节,fhlA在骨骼肌中特异表达,在20-25体节时期,fhlA在骨骼肌和心脏中同时表达,25体节以后,fhlA只在心脏中表达,胚胎发育到24hpf与48hpf之间,fhlA在心脏的房室间隔以及血液流出道中特异表达,到了 72hpf以后,检测不到fhlA在核酸水平的表达。利用心脏特异表达绿色荧光的转基因品系Tg:Nppa以及心脏细胞核中特异表达红色荧光的转基因品系Tg(cmlc2::dsRed2-nuc)为材料,用Morpholinos敲低技术,结果表明:胚胎发育到52hpf,敲低fhlA以以后,斑马鱼的心脏显著增大,原位杂交实验也得到相同的结果。心肌分化特异性标志基因myl7、amhc、vmhc和bmp4原位杂交实验结果表明fhlA能够抑制心脏早期的发育。此外,原位杂交实验表明f外A在第二生心区的前体细胞中特异表达并且能够强烈抑制第二生心区标志基因(如Islet1和Hand2)基因的表达。心脏剥离实验结果和心肌细胞数目计数结果表明,在胚胎发育到72hpf,敲低fhlA后,斑马鱼心脏变大,心房和心室的细胞数目反而减少,过表达fh1A后,斑马鱼心脏变小,但是心房和心室的细胞数目反而增多,说明在斑马鱼心脏发育后期,fhlA在限制细胞大小的同时能够促进心肌细胞的增殖。用MyoD的探针做原位杂交并且用MF20抗体进行胚胎抗体染色,结果显示fhlA能够促进斑马鱼的骨骼肌发育。接下来,用myl7和MyoD同时做原位杂交,实验表明,当fhlA被敲低以后,斑马鱼心脏变大,骨骼肌标志基因的表达时间比正常的变短,骨骼肌的发育受到抑制;当过表达fhlA后,心脏发育受到抑制,而骨骼肌标志基因表达消失的时间被推迟,说明能够促进骨骼肌的发育。该结果证明fhlA能够通过促进骨骼肌的发育抑制心脏的发育。本研究第一次在体内发现单个基因拮抗地调控心脏和骨骼肌发育过程。