论文部分内容阅读
胶质瘤是由神经外胚层分化而来的胶质细胞发生的肿瘤,是最常见的原发性颅内肿瘤。中国颅内肿瘤的平均年发病率为10/10万,其中胶质瘤占40%-67%。由于胶质瘤呈浸润性无限制增生,与正常脑组织无明显界限,而且富于血管,手术很难完全切除。运用现代显微外科技术、放疗、化疗等综合治疗措施后,胶质瘤患者预后仍不理想。该情况在近30年的临床实践中未得到根本改善。因此胶质瘤仍是神经系统的难治性疾病,相关研究内容是神经系统的热点课题。单纯手术治疗预后较差,如今多采用手术治疗辅助放疗和化疗的综合治疗的手段,但恶性胶质瘤的总体治疗效果仍不尽如人意,因此寻找有效地治疗手段势在必行。近年来,由于分子生物学取得的突破性进展,目前许多研究表明,胶质瘤的恶性进展涉及信号转导通路的异常,这为开辟新的治疗手段提供了新思路,因此采取针对肿瘤细胞内传导通路上的特异分子的生物靶向药物治疗癌症已经成为新的发展趋势。Wnt/β-catenin信号途径在胚胎发育过程以及多种肿瘤的发生、发展中起重要作用.由于其在人类不同肿瘤中的广泛激活,调节细胞的生长、迁移和分化,已被公认为肿瘤发生过程中关键的信号通路之一。近年来大量文献报道了Wnt通路在恶性胶质瘤中异常激活,其重要作用因子beta-catenin的表达情况与病人的预后及生存质量关系密切。Wnt通路是一条十分保守的信号传导通路.从低等生物果蝇直至高等哺乳动物,其成员都具有高度的同源性.Wnt信号通路不仅在胚胎发育过程中具有重要作用而且在各种肿瘤中表现为异常激活状态,也是现阶段研究最深入的分子通路,其在胶质瘤的发生发展过程中也发挥了巨大的影响着包括恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等各种恶性表型在内的生物学行为。现已有大量研究证实,miRNA表达谱紊乱在癌症发生过程中起着重要作用。在慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌等等在内的许多其他器官系统肿瘤中均存在miRNA表达谱的紊乱。特异性的miRNA表达紊乱可以被认为是新的肿瘤分子标签。目前研究证实niRNA的主要致癌机制是与编码基因的3’端结合,mRNA3’UTR的5’端有长度为6-8个碱基被称为miRNA结合种子序列。现在认为,miRNA调控基因表达的方式与miRNA和种子序列的互补程度有关。在哺乳动物、线虫、果蝇中,大多数miRNA和种子序列不完全互补的方式结合发挥抑制nRNA翻译成蛋白的作用。而在植物中,niRNA则是通过和种子序列完全互补进而介导mRNA降解的方式来调节靶基因的表汰。由于在哺乳动物细胞里,niRNA的不完全互补作用方式决定了一个miRNA可以有多个作用靶基因；相应地,某一个mRNA3’UTR种子序列也可以受众多miRNA的调控作用。尽管目前miRNA在胶质瘤中的研究仍处于起步阶段,但已有大量文献报道在神经胶质瘤中表达水平异常的miRNA可能发挥类似癌基因或抑癌基因的作用,为神经胶质瘤的诊断与治疗提供了新的方向。本课题从基因网络分析和体内外实验重点研究胶质瘤细胞中miR-21受β-catenin/TCF-4复合物的转录调控,为其直接靶点。本课题研究分以下三部分：第一部分：TCF4/TCF7L2通过与miRNAs启动子区相结合而调控其转录。应用TCF4ChIP-ChIP分析6,868个TCF4结合峰值从中找出TCF4结合区周围的miRNAs。ChlP-PCR检测在LS174T、MSF-7和U87三个不同细胞系中TCF4与miRNAs的启动子区相结合。第二部分：阿司匹林通过阻断Wnt信号通路而改变胶质瘤细胞的恶性表型的研究。TOP-FOP实验检测加入阿司匹林组后Wnt通路的活性,RT-PCR、 Westeron Blot检测Wnt信号通路下游靶点的变化。MTT实验检测阿司匹林处理后细胞增殖的变化；FCM实验评价细胞周期的改变；Annexin V实验检测阿司匹林组与对照组细胞凋亡率的变化；transewell实验检测胶质瘤细胞侵袭能力的改变。第三部分：验证TCF4/TCF7L2对miR-21的直接调控作用。应用各种体内外实验western blot、pcr、免疫组化及荧光素酶等证明miR-21是Wnt/β-catenin信号通路的直接靶点。