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体细胞克隆技术,及其与基因打靶技术的结合为哺乳动物的遗传工程和基因组保存提供了新的机遇和方法。小型猪是一种常用的实验动物,在世界上通过体细胞克隆猪虽已获得成功但是效率还很低,因此许多实验室正在努力提高这一克隆技术。本实验针对这一问题进行了研究,在卵母细胞去核技术上进行了改进,以提高克隆胚胎的体外发育率,从而提高克隆效率。并且获得了世界首例通过Spindle-view系统操作的克隆猪。同时我们也进行了转基因克隆猪方面的研究。
通过研究不同的培养条件,发现选用mTCM199和NCSU-23都可以获得较好的卵母细胞成熟效果。研究不同激活条件和培养条件,发现采用2.0KV,60us,一次电击,并且加以1.9mM 6-DAMP辅助激活可以获得较好的孤雌激活效果。NCSU-23是一种很好的猪胚胎培养液。
通过对猪胎儿组织的体外培养、冻存和复苏的实验研究,建立了猪胎儿成纤维细胞的培养和保存体系。在不同处理后的细胞周期的研究中发现血清饥饿培养不能显著提高猪胎儿成纤维细胞G0/G1期细胞的比例。
在卵母细胞去核操作过程中我们对MII期卵母细胞纺锤体和第一极体的相对位置变化进行了研究,发现随着体外成熟时间的延长,纺锤体与第一极体的相对位置发生改变,因此采用盲吸法将出现误差。我们采用了Spindle-view系统进行去核操作,并且获得了很高的去核效率。在核移植实验中发现,经过血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞的克隆胚胎,比未经血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞的克隆胚胎在胚胎发育率上有所提高但未出现明显差异。将来源于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞的克隆胚胎移植给5头受体母猪,平均每头移植174枚胚胎。P1378号受体于怀孕第114天产下克隆猪,克隆猪出生时体重1.15Kg,外表呈现黑白相间颜色,和供体细胞猪外表一致,并且发育正常。P1360号受体在50天时采用B超检测认定怀孕但是于第81天出现流产。P1390号受体于第二个情期出现返情。P3232号受体和P2598号受体分别于第一个情期出现返情。微卫星分析证明出生克隆猪的遗传物质和供体细胞猪一致。这说明利用Spindle-view系统可以成功的获得克隆猪。
在转基因克隆猪的研究中。我们通过LipofectamineTM 2000脂质体转染的方法对猪胎儿成纤维细胞进行转染,并且采用G418对其进行筛选,获得了稳定的转EGFP猪胎儿成纤维细胞系。采用转染的细胞进行核移植研究,获得了转EGFP胚胎。将转EGFP胚胎移植给3头受体并未获得出生的转基因克隆猪。