论文部分内容阅读
猪肌肉的生长和发育受多种基因家族的调控，包括原肌球蛋白基因、肌球蛋白基因、肌动蛋白基因、肌钙蛋白基因等家族。骨骼肌快肌肌钙蛋白C(Fast Skeletal Troponin C，TNNC2)是肌钙蛋白基因(Troponin)家族成员之一，具有Ca2+结合及调节位点，参与了细胞内Ca2+的信号传导，主要调控骨骼肌快肌收缩，进而影响肌纤维的生成。因此，研究TNNC2基因的结构和功能对进一步探讨肌纤维生长和肌肉收缩的分子机制有一定的意义。本研究在前人获得TNNC2基因的基础上，应用RT-PCR及RACE法分离和克隆了猪TNNC2基因全长cDNA和完整的基因组序列，通过比较基因组学和生物信息学方法，对该基因进行了序列分析、蛋白质结构功能的预测和系统进化分析；同时采用SDS-PAGE、Westem blot、Northern blot、DNA池结合测序等方法对该基因进行原核体外表达、组织表达规律和多态性筛查分析等研究，以了解猪TNNC2基因功能与表达调控机制。取得的主要研究结果如下：
1.采用RT-PCR和RACE方法，分离并鉴定了猪TNNC2基因全长cDNA序列，长度为722 bp，其中5’UTR 65 bp、3’UTR 174 bp、ORF 483 bp，编码160个氨基酸，提交GenBank收录，登录号为EU131524。
2.应用生物信息学方法，对猪TNNC2基因进行序列分析和功能预测，结果发现：该基因CDS和氨基酸序列与其他哺乳类动物同源性很高，均达到905以上；该基因编码的160个氨基酸残基中包含了4个EF手图像钙离子结合功能域。
3.采用Northern blot方法对猪TNNC2基因在蓝塘猪11个组织中的表达进行验证，结果显示：该基因只在猪肌肉(背最长肌、臂三头肌、股二头肌)中特异性表达，其他组织不表达；Northern杂交得到约700 bp的特异条带，与拼接得到的722 bp非常接近，从而也验证了所克隆得到的猪TNNC2基因cDNA即为全长cDNA，同时揭示该基因只有一个转录本。
4.采用SDS-PAGE和Westhem blot方法对猪TNNC2基因的原核体外表达进行初步研究，结果显示：构建成功的pRSET A-TNNC2-BL21重组质粒转化E.coli BL-21(DE3)表达菌后，成功表达出约24 kD的融合蛋白，最佳诱导时间为4 h，最佳的IPTG诱导浓度为0.2～0.6 mmol/L，表达产物以可溶性蛋白的形式存在。
5.利用比较基因组学和生物信息学方法初步推测出猪TNNC2基因包含6个外显子与5个内含子；参照人和鼠该基因的基因组结构，以猪TNNC2基因全长cDNA序列为基序，首次克隆出猪TNNC2基因的5个内含子；通过序列拼接得到长度为3199bp的TNNC2基因的全基因组序列，提交Genbank收录，登录号为EU131525。
6.利用DNA池结合测序技术对猪TNNC2基因全基因组序列进行多态性筛查，共发现20个SNPs，其中3个位于编码区，17个位于非编码区；位于编码区的3个SNPs都为错义突变(2676 A>G突变位点导致第133位Glu→Gly的替换，2722 C>G突变位点导致148位Asp→Glu的颠换，2725 C>G突变位点导致149位Phe→Leu的颠换)。
7.采用PCR-RFLP方法，检测126T>C、175A>G、280T>C、437T>C、143l C>T5个多态位点的基因型在群体中的分布，发现5个位点在外国猪种(杜洛克猪、大白猪和长白猪)和本地猪种(蓝塘猪和大花白猪)的基因型和基因频率分布差异大。5个位点只有在大花白猪中分布比较均衡，在其它群体中都出现Hardy-Weinberg平衡偏倚。