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尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界性养殖鱼类,其雄鱼比雌鱼生长快50％,全雄鱼的养殖具有更好的经济价值;而罗非鱼又是研究性别决定与分化的好材料,目前国际学术界对硬骨鱼类性别决定与分化的分子机制的研究主要集中在青鳉、虹鳟和罗非鱼。因此,以罗非鱼为材料开展有关性别分化与性别控制方面的研究,可以兼顾基础与应用两个方面。3月龄的尼罗罗非鱼雌雄性腺分别处于卵子生长和精子发生的关键期。本研究采用转录组学的研究方法,对3月龄罗非鱼雌雄性腺中与性别决定和分化密切相关基因的表达情况进行了比较分析;利用芳香化酶抑制剂Fadrozole成功诱导3月龄雌性罗非鱼逆转为功能型雄鱼,并对转录组检测到的一些与性别决定与分化相关基因在性逆转过程中的表达变化情况进行了研究,主要研究结果如下:
1.以3月龄罗非鱼精巢和卵巢mRNA为材料,分别构建测序文库然后进行测序。在卵巢文库获得26,466,668 reads,共2,382,000,120个碱基;精巢文库获得26,292,052 reads,共2,366,284,680个碱基。转录组测得的数据经分析拼接共得到74865个高质量的单基因簇(Unigene),经过对转录组中所有类固醇合成酶基因的分析,我们估算每个基因大约被注释4.9次,因而罗非鱼转录组测到的基因大约为15279个。使用BLAST软件将这些序列同Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等数据库进行比对、查询、注释和分类,结果显示,6723条序列与已知序列有相关同源性(E＜1e-5),8556条序列没有明显的同源性,但是也同时揭示出在这些序列中能够发现新功能基因的相当可能性。从COG和KEGG数据库的功能分类结果显示,性腺中表达最多的几类基因包括细胞周期的控制、翻译后修饰、核糖体的结构形成,能量产生和转换,活跃表达的基因主要是维持生命活动的必须基因,说明3月龄的尼罗罗非鱼性腺组织中是以基础代谢、生长发育作为它主要的生命过程。其中,在卵巢中表达最高的几类基因是脂肪酸结合蛋白、细胞周期调控蛋白、肌动蛋白和透明带精子贴附蛋白,暗示此时卵巢为卵子进入大生长期积累物质和能量;在精巢中表达比较高的几类基因是氧化还原酶类、ATP依赖的解旋酶类以及细胞分化相关因子,说明3月龄的精巢处于旺盛的细胞分裂阶段。对卵巢和精巢的数据进行对比分析,发现精巢特异(相对于卵巢)表达的基因大约有1309个,卵巢特异表达的基因大约有786个,精巢和卵巢都有表达的基因大约有13053个,其中大约有5015个基因没有明显差异;有8038个Unigene的雌雄表达差别在2倍以上,其中雄性比雌性表达高的有5778个,而雌性比雄性表达高的有2260个,由此看来,精巢比卵巢表达的基因更多、更活跃。对差异基因做pathway功能富集,结果显示有1321个差异基因参与到104个通路中,包括代谢途径(19.22％)、MAPK.信号通路(10.32％)、细胞周期(9.86％)、减数分裂(7.26％)、淀粉和蔗糖代谢(6.04％)、次级代谢产物的生物合成(4.91％)和剪接体(4.43％)等通路。2.对已知的与性别决定分化相关基因在转录组中的表达情况进行分析,结果显示在鱼类性别决定和分化过程中表达且起关键作用的在雌性表达高的Cyp19a1a、Fox12、Gdf9、Nup62,Vldr和在雄性表达高的Dmrtl、Amh、Fshr、Inha等在3月龄罗非鱼性腺中仍然有表达,且此时它们在雌雄性腺的表达模式与性别决定分化时期在性腺的表达模式一致,这说明这些基因不仅参与了鱼类的性别决定与分化,而且对性腺的发育和维持也具有重要作用。对类固醇合成酶基因的表达情况分析发现,除了Cyp19a1a、Cypl9a1b、3β-HSD2和17β-HSD1在雌性的表达明显高于雄性外,其他类固醇合成酶基因(Cyp11b1,P450scc,Starl、Star2、3β-HSD1、11β-HSD2和17β-HSD12b等)在雄性的表达量明显高于雌性,说明3月龄卵巢需要更高雌激素维持卵子生长,而3月龄的精巢有更旺盛的雄激素的合成,也进一步说明精子发生需要大量的雄激素来维持。研究还表明,一些在鱼类的性别决定和分化过程中有高表达的基因,在3月龄的罗非鱼性腺中却检测不到表达,说明其很可能只与性别决定与分化有关,而不参与罗非鱼性腺的发育和维持过程(如Pax2a、Gjal、Lhr、Fshb,Ovoll、Fgf6、Stc1、Inhbb、Sox23、Sox24、Lhb、Tegt等)。另外,一些在鱼类性别决定和分化期的表达有明显性别二态性的基因,在3月龄的性腺其表达被反转(如Casp6、Akr1d1、Mapk3、Lifr、Magoh、Tra2a,Aldob,Casp3,Fancl、Eif2s3等),暗示这些基因在鱼类性腺发育的不同时期可能行使不同的功能,其具体原因还值得深入研究。
3.翼状螺旋/叉头状转录因子超家族(winged helix/forkhead transcriptionfactor,FOX)是一类调节核蛋白,目前在人类发现了50个Fox。研究表明其家族成员FoxL2在脊椎动物性别决定和分化过程中有重要作用,而其他成员在鱼类性别决定和分化方面的功能还知之甚少。对3月龄罗非鱼性腺转录组的表达情况分析表明,有29种Fox基因能够检测到表达,其中有12个在卵巢的表达量高于精巢,有17个在精巢的表达量高于卵巢。对雌雄表达量较高且差异最大的FoxH1和FoxJ1a的表达模式进行深入研究表明,FoxH1在精巢检测不到表达,而在卵巢的表达量很高,而Foxd1a在精巢的表达量明显比卵巢高。原位杂交结果显示,FoxH1表达于卵巢卵母细胞,而Foxd1a表达于精巢的次级精母细胞。个体发生研究显示,FoxH1在罗非鱼孵化后20天即表现出明显的雌雄差异,而FoxJ1a在罗非鱼孵化后3月龄之前雌雄性腺均检测不到表达,在3月龄后至成体精巢的表达量都明显高于卵巢。这暗示FoxH1很可能与罗非鱼卵子发生密切相关,而FoxJ1a则很可能与罗非鱼精子发生密切相关。
4.利用芳香化酶抑制剂Fadrozole成功诱导3月龄雌性尼罗罗非鱼卵巢逆转为功能型精巢,通过对性腺组织切片观察,发现3月龄卵巢向精巢的转变是一个由腹部向背部、由后部向前部的渐变过程;通过实时定量PCR检测了在3月龄性腺转录组中仍能检测到表达的性别决定与分化相关基因表达变化情况,结果显示,在性逆转过程中,与对照组相比,在处理开始后45天(45dat,days after treatment),处理组芳香化酶基因Cyp19ala表达水平明显升高,到70dat处理组与对照组没有明显差异,直到90dat处理组明显低于对照组,暗示Fadrozle处理3月龄罗非鱼卵巢会引起Cyp19ala的表达代偿性升高,这一结果与芳香化酶蛋白水平在性逆转过程中的变化情况一致;转录因子Sf1在性逆转过程中的表达变化规律与Cyp19ala一致;Foxl2在0-20dat处理组与对照组没有明显变化,随后处理组明显低于对照组,且其下调的时间早于Cyp19ala;Dmrtl在0-45dat,处理组与对照组表达量都非常低,且没有明显差异,直到70dat,处理组明显高于对照组。结合本实验室以前的研究结果,我们认为雌激素的水平不仅决定着鱼类性腺向卵巢分化,而且其对卵巢的维持具有重要意义。