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干扰素调节因子(IRFs)是一类多功能的转录因子,能与干扰素(IFN)基因启动子及干扰素刺激应答基因(ISG)中的干扰素刺激性反应元件(ISRE)特异性结合,激活相关的信号;并调节靶基因的表达。在干扰素转录调控、病原体免疫反应、细胞因子信号转导、抗病毒感染、细胞增殖调控以及造血干细胞的发育、淋巴细胞的分化、自稳平衡,先天性免疫和适应性免疫调控等方面起着重要作用。目前在脊椎动物中已有10个成员被陆续报道,但这些研究主要集中在哺乳类和一些真骨鱼类。本研究首次从软骨鱼类的鲨鱼、总鳍鱼类的肺鱼、爬行类的蝮蛇和软骨硬鳞鱼类的匙吻鲟中克隆出IRF基因并开展了相应的进化和表达分析研究。本研究拓展了我们对IRF基因家族在物种进化上的视野,为进一步的研究打下了坚实的基础。具体研究结果如下:
⑴克隆了匙吻鲟IRF-1、IRF-2、IRF-5的cDNA全序列;匙吻鲟IRF-5基因全序列;非洲肺鱼IFR-1的cDNA序列;条纹斑竹鲨IRF-1的cDNA全序列和短尾蝮蛇IRF-2的cDNA全序列;测序结果显示:匙吻鲟IRF-1的cDNA全长为1858bp(GenBank序列号:JF51656),包含一个972bp的开放阅读框(ORF),122bp的5UTR和764bp的3UTR。匙吻鲟IRF-2的cDNA全长为1767bp(GenBank序列号:JF51657)。包含一个1023bp的ORF,193bp的5UTR和551bp的3’UTR。匙吻鲟IRF-5的cDNA长度为2178bp(GenBank序列号:JF511656),它包含一个1491bp长的一个ORF,335bp的5UTR和352bp的3UTR。鲨鱼IRF-1的cDNA全长为1642bp,包含一个1008bp的ORF、88bp的5UTR和546bp的3UTR(GenBank序列号:HQ044308)。肺鱼IRF-1的cDNA序列克隆到一个942bp的ORF和399bp的3UTR(GenBank序列号:HQ873639)。短尾蝮蛇的IRF-2的cDNA序列克隆到一个948bp的ORF和137bp的3UTR(GenBank序列号:HM126489)。匙吻鲟IRF-5基因组序列长度为5095bp(GenBank序列号:JF511655),由8个外显子和7个内含子组成。
⑵比较分析了软骨鱼类、肉鳍类(包括肺鱼和四足类)和辐鳍类(包括硬鳞鱼类和真骨鱼类)的IRF-1、IRF-2和IRF-5cDNA的序列差异。比对结果显示从软骨鱼类、真骨鱼类和哺乳类,IRF-1、IRF-2和IRF-5在序列上都具有相似性,特别是推导的氨基酸序列。在所克隆的IRF基因中均辨别出DNA绑定模体(DBD),在IRF-1、IRF-2和IRF-5的DBD中均能找到5个色氨酸重复模体。在IRF-1和IRF-2中我们辨别出了转录活化模体(TAD)和干扰素相关结构域2(IAD2)。在IRF-2中辨别出了抑制模体(RD)。比对的结果显示匙吻鲟IRF-5基因的结构与哺乳类相似都为8个外显子,它们的第一外显子大小相近,例如马IRF-5的第一外显子为195bp。而匙吻鲟IRF-5基因第一外显子为174bp,是斑马鱼第一外显子和第二外显子(51,123bp)加起来的总和(斑马鱼的基因有9个外显子)。
⑶在推导的IRF-1、IRF-2和IRF-5氨基酸序列基础上使用NJ、ML、BI方法对硬骨类进行了系统发育重建和分子进化分析。结果显示IRF-1,IRF-2和IRF-5都具有明显的系统发育意义:首先IRF-1, IRF-2和IRF-5各自形成单系,每个分支分为辐鳍和肉鳍类,四足类形成单系类群与肺鱼形成姊妹群。在辐鳍鱼分支,匙吻鲟一般位于分支的基部。大部分的分支节点都得到高的重抽样支持率。
⑷RT-PCR的方法检测了IRF-1,IRF-2和IRF-5基因mRNA在匙吻鲟正常个体不同组织的表达水平。结果显示它们在脑、鳃、肠、心、头肾、中肾、肝和脾中均为组成性表达。但它们在不同组织中的表达水平存在一定差异(图3-7)。IRF-1基因在肝、鳃、头肾、中肾、肠和脾中表达水平较高,在脑和心组织中表达水平较低。IRF-2基因在各组织中的表达水平总体上较IRF-1基因偏低。IRF-2在鳃和头肾中表达水平较高,中肾、脾、肝组织中表达水平稍低,而在脑和心组织中仅有微量表达。IRF-5基因在鳃组织中有比较高的表达水平,在脾和头肾中表达水平稍低,而在肝、脑、心、中肾和脾仅有微量表达。
⑸使用干扰素诱导剂聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid,poly(I:C)诱导匙吻鲟各组织,例如鳃、头肾、中肾、肝、脾的表达变化:在注射poly(I:C)24h后,匙吻鲟IRF-1基因在肝、脾和中肾的表达水平与对照PBS(磷酸缓冲液)相比增加了7-8倍,呈显著性差异;IRF-2的基因表达水平为对照的2-3倍。IRF-5基因的表达水平则对该刺激没有反应;
⑹Southern杂交检测匙吻鲟IRF-1,IRF-2和IRF-5在基因组中的拷贝数,结果显示IRF-1和IRF-2在匙吻鲟基因组中都是单拷贝基因;而IRF-5在匙吻鲟基因组中不止一个拷贝。