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山西老陈醋是我国最驰名的谷物醋之一，经酒精发酵后采用固态醋酸发酵，再经熏醅、陈酿等工艺酿造而成。山西老陈醋独特风味品质的形成不仅依赖于其特殊原料及工艺，而且发酵过程中的微生物也起着非常重要的作用，其中乳酸菌代谢产生大量乳酸，一方面可降低原料中的pH，抑制杂菌生长；另一方面作为食醋不挥发性酸的主体部分，能与发酵过程中产生的醇类反应生成酯类，构成食醋的香气成分。 本课题组在前期研究中，采用变性凝胶电泳方法对山西老陈发酵阶段的微生物多样性进行了分析，发现2种优势乳酸菌菌群以较高的丰度出现在几乎整个发酵过程中。为进一步研究山西老陈醋发酵过程中乳酸菌及其代谢信息，本研究采用纯培养方法从食醋发酵醪中分离乳酸菌，对其进行分子生物学的分型聚类和种属鉴定；在此基础上，筛选菌株进行体外益生特性测试，包括对酸液、人工胃肠液、胆盐等不良环境的耐受性测试以及对常见有害细菌的抑制作用研究；筛选耐受性强、抑菌作用明显的菌株用于酸豆乳发酵，并优化确定最佳发酵工艺，检测此条件下发酵产品的感官指标和营养指标，并检测大豆豆腥味是否有改善，以验证所筛选的乳酸菌用于发酵酸豆乳的可行性；另外采用苹果块作为固定化载体包埋乳酸菌用于发酵酸豆乳以进一步改善风味，主要研究内容如下： 1.山西老陈醋发酵阶段乳酸菌的分型聚类和种属鉴定 以山西老陈醋发酵不同天数的样品为原料，分离得到28株乳酸菌，采用细胞总蛋白 SDS-PAGE、ERIC-PCR、PCR-RFLP等标记技术分别进行聚类分析并与16S rDNA序列分析相结合来进一步鉴定，结果显示：不同聚类方法都能较好地与16S序列分析相对应，28株乳酸菌鉴定结果为：10株发酵乳杆菌（ Lactobacillus fermentum）、4株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、5株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、3株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、3株融合乳杆菌（Weissella confusa）、2株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和1株布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。 2.乳酸菌益生特性分析 从28株分离菌株中选取生长速率快且生长状态良好的10株乳酸菌进行体外益生特性测试，依据其对低pH，人工胃肠液的耐受作用以及对胆盐的抗性，筛选耐受性较强的菌株，对其抑制致病菌的能力进行研究，结果发现：发酵乳杆菌 L3-2和L6-2，植物乳杆菌L4-1以及干酪乳杆菌L4-4这四株菌体外耐受作用较好，对胆盐的抗性高，且抑菌作用明显；另外，通过 SDS-PAGE电泳分析，发现10株乳酸菌对导致动物腹泻的大豆抗原蛋白都有不同程度的降解作用。 3.乳酸菌发酵豆乳研究 综合乳酸菌的益生特性、分解作用以及发酵特性，最终确定以干酪乳杆菌L4-4和发酵乳杆菌 L6-2进行混合发酵，在单因素实验的基础上，采用 BoxBenhnken Designs（BBD）试验设计及响应面分析确定了豆乳发酵的最优工艺条件：豆水比为1:8，菌种配比为1:1，接种量5％，发酵时间12 h，发酵温度35℃，此条件下得到的酸豆乳产品细腻润滑、质地均匀、酸甜适宜并伴有奶香风味，说明混菌株发酵综合利用了2菌株各自的优势，达到了菌种复配的优化作用。此外，分析了最优条件下发酵酸豆乳中营养指标和风味成分的变化，发现脂肪含量有所减少，而还原糖和游离氨基酸含量明显增多，说明发酵以后的酸豆乳更利于人体吸收；并且经发酵以后，具有豆腥气的呋喃类物质显著降低，具有芳香气味的酮基类物质明显增多，提高了发酵乳的接受度。 4.固定化乳酸菌发酵初探 国外研究表明：以水果或谷物作为大分子固定化载体包埋微生物用于食品发酵，不仅仅是基于食品级包埋材料的角度出发，而且它更具有改善风味，用于连续生产等多方面的优势。本实验利用苹果块作为载体包埋乳酸菌用于酸豆乳发酵，并与游离细胞发酵进行比较；经 GC-MS分析发现固定化细胞发酵乳中具有芳香气味的酮基类物质进一步增多，使发酵乳兼具了奶香和果香风味，产品的接受度更高；在连续发酵实验中，固定化细胞更为稳定；用于制备冻干发酵剂时，固定化细胞冻干以后的存活率高达80%，且复苏效率没有明显下降，说明固定化载体同样具有冻干保护剂的作用，充分说明固定化细胞发酵比游离细胞发酵更具优势，同时也为乳酸菌的保藏提供了一种思路。