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一、吡唑并嘧啶类化合物的药理活性筛选
本论文将体外活性评价与体内活性筛选相结合，初步建立了镇静催眠药物的药效筛选评价体系，该评价体系主要由药物与戊巴比妥钠所致小鼠睡眠实验方法、小鼠自主活动测试和利用γ-GABAA受体与配体(3H-Muscimol)结合实验模型对目标化合物进行评价构成。评价的目的在于:首先，通过对γ-GABAA受体与配体(3H-Muscimol)结合实验模型的研究，从大鼠脑皮质中分离纯化γ-GABAA受体，作为药物筛选靶点，通过与放射性配体(3H-Muscimol)结合实验，来筛选评价目标化合物与γ-GABAA受体结合能力。进一步通过药物与戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的协同作用，提供药物是否具有中枢抑制作用的初步药效评价信息。该评价体系准确、可靠，从不同角度进行了初步活性筛选。
用大鼠脑皮质分离制备的γ-GABAA受体作为药物筛选靶点，通过与放射性配体(3H-Muscimol)结合实验，筛选吡唑并嘧啶类化合物的生物活性，其中以茚地普隆(indiplon，IDP)作为阳性对照，分别对17个化合物进行竞争性抑制实验，并计算出抑制率(％)。结果显示:化合物WL1、WL4、WL6、WL10，WL19、WL21对放射性配体(3H-Muscimol)有一定的竞争性抑制作用，且随着浓度的降低，仍然保持抑制作用，其中化合物WL6、WL10、WL19的抑制作用比阳性对照较为明显。
分别以睡眠发生率、睡眠作用持续时间为指标，对23个吡唑并嘧啶类新化合物进行催眠活性筛选。将各药物以相同剂量(5mg/kg)灌胃给药，给药后30min再分别腹腔注射戊巴比妥钠，当注射剂量为阈下剂量(25mg/kg)时，记录睡眠发生率，当注射剂量为阈上剂量(50mg/kg)时，记录睡眠持续时间，结果显示WL2、WL6、WL19等3个化合物表现出一定的催眠活性。
采用自发活动测试仪和观察翻正反射消失与否及翻正反射消失至恢复的持续时间，研究WL6对戊巴比妥钠诱导的镇静催眠作用。结果显示:与空白对照组比较，WL6低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)各剂量组均能抑制正常小鼠的自发活动，且呈量效关系:单用阈下剂量的戊巴比妥钠(25mg/kg)未出现催眠效应，但与戊巴比妥钠联用的WL6低(lmg/kg)、中(3mg/kg)、高(5mg/kg)三个剂量组，均有不同数量小鼠入睡，且呈明显的量效关系，其中中(3mg/kg)、高(5mg/kg)剂量组能显著地增强阈下剂量的戍巴比妥钠的催眠作用(p＜0.05)，提示WL6对戊巴比妥钠有明显的协同作用;Smg/kg剂量组的WL6能较好地发挥加强阈上剂量(50mg/kg)的戊巴比妥钠的协同作用，睡眠持续时间为194.33±7.68min。
综合体外体内评价结果，通过与放射性配体(3H-Muscimol)竞争性抑制实验，阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验，阈上剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验及自发活动试验的检测，表明WL6具有明显的镇静催眠作用，其作用机制作用于GABAA受体。
二、WL6的质量研究
本文对WL6进行了质量研究，研究项目包括性状、鉴别、检查和含量测定。
对三批原料药WL6的性状(外观、溶解度、熔点、引湿性、吸收系数)进行了考察，结果，本品为黄色或类黄色粉末，在吡啶、二甲基亚砜中略溶，在氯仿中微溶，在乙腈、四氢呋喃、冰醋酸、O.1mol/L盐酸、O.lmol/L氢氧化钠中极微溶解，在甲醇、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、水中几乎不溶。熔点为272.2～273.7℃，略有引湿性，WL6的紫外.可见光的最大吸收波长为269nm±2nm，吸收系数E1％1cm为589.8。
WL6的鉴别试验采用了薄层色谱法、紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法，薄层色谱法显示三批供试品溶液所显示主要斑点的荧光和位置与对照品溶液所显示主斑点的荧光和位置相同;紫外-可见吸收光谱法显示三批样品均与对照品紫外图谱一致，均在269nm处有最大吸收;高效液相色谱法显示三批样品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致。以上三种鉴别方法专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便。
检查项考察了酸碱度、氯化物、硫酸盐、干燥失重、炽灼残渣、重金属、砷盐等，结果本品水溶液近中性，氯化物小于0.005％，硫酸盐小于0.05％，干燥失重小于0.5％，炽灼残渣小于0.1％，重金属小于10ppm，砷盐小于2ppm，以上检查均符合规定。
建立了HPLC-UV测定原料药WL6含量的分析方法，色谱柱:DiamonsilC18(250mmx4.6mm，5μm)，流动相:乙腈-水(40∶60)，流速:1.0ml/min，检测波长:269nm，柱温:室温，进样量:20μl。在该色谱条件下，理论板数按WL6峰计算不低于5000，分离度大于1.5。并对该方法进行了方法学考察，表明本品在8μg/m1～120μg/ml的浓度范围内，浓度与相应的峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999);定量限和检测限分别为7.2ng和2.16ng;重复性考察RSD=0.79％(n=6)＜2％;日内、日间精密度试验的RSD均小于2％，说明该液相含量测定方法灵敏、准确、重现性好，故本方法可用于WL6的含量测定。本品含量按干燥品计算为98.0％～102.0％。
WL6有关物质检查方法采用原料药含量测定的分析方法，检测浓度为含量测定浓度的5倍。通过破坏性试验考察，显示主峰与破坏产物得到了很好的分离，主峰与各杂质峰之间的分离度大于1.5，理论塔板数按主峰计大于5000。WL6在强碱条件下很不稳定，于供试品溶液中加入1m01/LNaOH溶液1ml，在室温下放置5.5h后，主峰含量下降至53.49％(归一化法测定)，破坏降解出4个杂质;向供试品溶液中加入1mol/LHCI溶液1ml，于70℃水浴加热7h后，WL6含量下降至94.45％(归一化法测定)，破坏降解出3个杂质;向供试品溶液中加入30％过氧化氢1ml，在室温下放置4h后，除新增溶剂峰外，未见新增杂质峰;本品在105℃条件下放置10h，未见新增杂质峰，因此本品对强酸、氧化和加热条件比较稳定，且各有关物质之间分离良好。进一步说明该分析方法专属性好。由于WL6主药与有关物质紫外吸收相似，三批原料药有关物质总量测定选用不加校正因子主成分自身对照法来计算，结果显示三批样品有关物质总量均小于1％。
三、WL6稳定性研究
影响因素试验分别考察了本品在高温(60℃)、高湿(25℃相对湿度90％±5％)、光照(照度为4500Lx±500Lx)等条件下的稳定性，为药物的包装、贮藏和运输等提供重要依据，结果WL6在上述条件下放置10天，性状、熔点、含量及有关物质各项指标基本稳定。
本论文将体外活性评价与体内活性筛选相结合，初步建立了镇静催眠药物的药效筛选评价体系，该评价体系主要由药物与戊巴比妥钠所致小鼠睡眠实验方法、小鼠自主活动测试和利用γ-GABAA受体与配体(3H-Muscimol)结合实验模型对目标化合物进行评价构成。评价的目的在于:首先，通过对γ-GABAA受体与配体(3H-Muscimol)结合实验模型的研究，从大鼠脑皮质中分离纯化γ-GABAA受体，作为药物筛选靶点，通过与放射性配体(3H-Muscimol)结合实验，来筛选评价目标化合物与γ-GABAA受体结合能力。进一步通过药物与戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的协同作用，提供药物是否具有中枢抑制作用的初步药效评价信息。该评价体系准确、可靠，从不同角度进行了初步活性筛选。
用大鼠脑皮质分离制备的γ-GABAA受体作为药物筛选靶点，通过与放射性配体(3H-Muscimol)结合实验，筛选吡唑并嘧啶类化合物的生物活性，其中以茚地普隆(indiplon，IDP)作为阳性对照，分别对17个化合物进行竞争性抑制实验，并计算出抑制率(％)。结果显示:化合物WL1、WL4、WL6、WL10，WL19、WL21对放射性配体(3H-Muscimol)有一定的竞争性抑制作用，且随着浓度的降低，仍然保持抑制作用，其中化合物WL6、WL10、WL19的抑制作用比阳性对照较为明显。
分别以睡眠发生率、睡眠作用持续时间为指标，对23个吡唑并嘧啶类新化合物进行催眠活性筛选。将各药物以相同剂量(5mg/kg)灌胃给药，给药后30min再分别腹腔注射戊巴比妥钠，当注射剂量为阈下剂量(25mg/kg)时，记录睡眠发生率，当注射剂量为阈上剂量(50mg/kg)时，记录睡眠持续时间，结果显示WL2、WL6、WL19等3个化合物表现出一定的催眠活性。
采用自发活动测试仪和观察翻正反射消失与否及翻正反射消失至恢复的持续时间，研究WL6对戊巴比妥钠诱导的镇静催眠作用。结果显示:与空白对照组比较，WL6低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)各剂量组均能抑制正常小鼠的自发活动，且呈量效关系:单用阈下剂量的戊巴比妥钠(25mg/kg)未出现催眠效应，但与戊巴比妥钠联用的WL6低(lmg/kg)、中(3mg/kg)、高(5mg/kg)三个剂量组，均有不同数量小鼠入睡，且呈明显的量效关系，其中中(3mg/kg)、高(5mg/kg)剂量组能显著地增强阈下剂量的戍巴比妥钠的催眠作用(p＜0.05)，提示WL6对戊巴比妥钠有明显的协同作用;Smg/kg剂量组的WL6能较好地发挥加强阈上剂量(50mg/kg)的戊巴比妥钠的协同作用，睡眠持续时间为194.33±7.68min。
综合体外体内评价结果，通过与放射性配体(3H-Muscimol)竞争性抑制实验，阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验，阈上剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验及自发活动试验的检测，表明WL6具有明显的镇静催眠作用，其作用机制作用于GABAA受体。
二、WL6的质量研究
本文对WL6进行了质量研究，研究项目包括性状、鉴别、检查和含量测定。
对三批原料药WL6的性状(外观、溶解度、熔点、引湿性、吸收系数)进行了考察，结果，本品为黄色或类黄色粉末，在吡啶、二甲基亚砜中略溶，在氯仿中微溶，在乙腈、四氢呋喃、冰醋酸、O.1mol/L盐酸、O.lmol/L氢氧化钠中极微溶解，在甲醇、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、水中几乎不溶。熔点为272.2～273.7℃，略有引湿性，WL6的紫外.可见光的最大吸收波长为269nm±2nm，吸收系数E1％1cm为589.8。
WL6的鉴别试验采用了薄层色谱法、紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法，薄层色谱法显示三批供试品溶液所显示主要斑点的荧光和位置与对照品溶液所显示主斑点的荧光和位置相同;紫外-可见吸收光谱法显示三批样品均与对照品紫外图谱一致，均在269nm处有最大吸收;高效液相色谱法显示三批样品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致。以上三种鉴别方法专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便。
检查项考察了酸碱度、氯化物、硫酸盐、干燥失重、炽灼残渣、重金属、砷盐等，结果本品水溶液近中性，氯化物小于0.005％，硫酸盐小于0.05％，干燥失重小于0.5％，炽灼残渣小于0.1％，重金属小于10ppm，砷盐小于2ppm，以上检查均符合规定。
建立了HPLC-UV测定原料药WL6含量的分析方法，色谱柱:DiamonsilC18(250mmx4.6mm，5μm)，流动相:乙腈-水(40∶60)，流速:1.0ml/min，检测波长:269nm，柱温:室温，进样量:20μl。在该色谱条件下，理论板数按WL6峰计算不低于5000，分离度大于1.5。并对该方法进行了方法学考察，表明本品在8μg/m1～120μg/ml的浓度范围内，浓度与相应的峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999);定量限和检测限分别为7.2ng和2.16ng;重复性考察RSD=0.79％(n=6)＜2％;日内、日间精密度试验的RSD均小于2％，说明该液相含量测定方法灵敏、准确、重现性好，故本方法可用于WL6的含量测定。本品含量按干燥品计算为98.0％～102.0％。
WL6有关物质检查方法采用原料药含量测定的分析方法，检测浓度为含量测定浓度的5倍。通过破坏性试验考察，显示主峰与破坏产物得到了很好的分离，主峰与各杂质峰之间的分离度大于1.5，理论塔板数按主峰计大于5000。WL6在强碱条件下很不稳定，于供试品溶液中加入1m01/LNaOH溶液1ml，在室温下放置5.5h后，主峰含量下降至53.49％(归一化法测定)，破坏降解出4个杂质;向供试品溶液中加入1mol/LHCI溶液1ml，于70℃水浴加热7h后，WL6含量下降至94.45％(归一化法测定)，破坏降解出3个杂质;向供试品溶液中加入30％过氧化氢1ml，在室温下放置4h后，除新增溶剂峰外，未见新增杂质峰;本品在105℃条件下放置10h，未见新增杂质峰，因此本品对强酸、氧化和加热条件比较稳定，且各有关物质之间分离良好。进一步说明该分析方法专属性好。由于WL6主药与有关物质紫外吸收相似，三批原料药有关物质总量测定选用不加校正因子主成分自身对照法来计算，结果显示三批样品有关物质总量均小于1％。
三、WL6稳定性研究
影响因素试验分别考察了本品在高温(60℃)、高湿(25℃相对湿度90％±5％)、光照(照度为4500Lx±500Lx)等条件下的稳定性，为药物的包装、贮藏和运输等提供重要依据，结果WL6在上述条件下放置10天，性状、熔点、含量及有关物质各项指标基本稳定。