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研究目的:
本课题组前期研究发现红桂木凝集素(ALL)能有效促进人外周血CD4+T淋巴细胞亚群的增殖，还能有效促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖。本实验首先将白桂木凝集素(AHL)、红桂木凝集素(ALL)作用于小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)，研究这两种凝集素对BmDC的分化、成熟、细胞因子释放、迁移、吞噬等方面的影响，探讨这两种凝集素对正常小鼠DC细胞的功能调控作用;其次将桂木凝集素作用于免疫系统的肿瘤细胞:人急性白血病T淋巴细胞(Jurkat T)、小鼠T淋巴瘤细胞(EL-4)，观察AHL、ALL对肿瘤细胞增殖的影响;再次为了探讨桂木凝集素在体内的免疫调控作用，将小鼠皮内免疫OVA/AHL/ALL，检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度，为本课题组今后的动物体内实验奠定基础。本研究进一步从分子水平探明AHL、ALL的免疫调控作用机制，并为其在临床疾病防治等方面的开发应用奠定良好的理论和实验基础。
方法:
一、对BmDC成熟的影响
无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以重组粒细跑-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)协同诱导下培养一段时间成为未成熟的树突状细胞后，加入不同浓度的AHL/ALL，作用48h后
1、倒置显微镜下观察细胞形态及数目的变化，应用CCK-8法检测细胞的增殖率;
2、应用荧光标记抗体结合荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cellsorting，FACS)检测BmDC表面协同刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达;
3、应用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测BmDC产生的细胞因子IL-12/P40和IFN-γ的水平;
4、以Transwell小室迁移实验分析BmDC迁移能力的变化;
5、以酵母菌的吞噬实验评估BmDC的抗原摄取能力。
二、对BmDC前体分化的影响
无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，在完全培养基中培养，同时添加不同浓度AHL/ALI。培养八天，以只有完全培养基培养的BmDC为阴性对照，阳性对照组的培养基为含有GM-CSF、IL-4而不含桂木凝集素的完全培养基
1、采用FACS分析细胞表面CD11c含量的变化;
2、应用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测树突状细胞产生的细胞因子IL-12/P40和JFN-γ的水乎。
三、对EL-4、JurkatT细胞增殖的影响
(1)本课题组前期已研究ALL对人急性淋巴细胞白血病JurkatT淋巴细胞增殖的影响，为了从多层面了解桂木凝集素的抗肿瘤作用，本实验将不同浓度AHL作用于JurkatT淋巴细胞，作用48h后，利用倒置显微镜及CCK-8法观察AHL对JurkatT淋巴细胞增殖的影响。
(2)常规培养小鼠T淋巴瘤细胞EL-4，将不同浓度桂木凝集素刺激EL-4细胞，作用48h后
1、利用倒置显微镜及CCK-8法观察AHL、ALL对小鼠T淋巴瘤细胞EL-4增殖的影响;@2、运用AnnexinV/PI双染法FACS检测，分析AHL、ALL对小鼠T淋巴瘤细胞EL-4凋亡的影响;
四、对小鼠体内OVA特异性IgG产生的影响
小鼠皮内注射OVA/AHL/ALL;两周后断尾取血，酶联免疫夹心法(ELISA)检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度。
结果:
一、对BmDC成熟的影响
CCK-8法结果显示AHL、ALL能显著促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)的增殖，且这两种桂木凝集素对BmDC的增殖作用具有剂量一效应关系。镜下可见BmDC数目明显增多，经不同浓度的桂木凝集素刺激后见较大体积的悬浮细胞，向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，低倍镜下可观察到随着AHL、ALL浓度的增加，细胞集落呈现更多更大的细胞团。说明AHL、ALL能够促进BmDC的增殖及集落的形成。
FACS分析证实AHL、ALL可促进BmDC表面协同刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅰ、Mmc-Ⅱ的表达，表明AHL、ALL可诱导BmDC的成熟。
ELISA检测培养细胞上清液中细胞因子IL-12/P40、IFN-γ的浓度，结果显示AHL、ALL能够促进这两种细胞因子的分泌，提示桂木凝集素可能诱导Th0细胞向Thl细胞分化，产生特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效应。
Transwell实验证实经AHL、ALL刺激成熟的BmDC迁移能力有所提高，但是与阴性对照组比较无显著性差异，p＞0.05。
酵母菌吞噬实验证明，经AHL、ALL刺激成熟的BmDC吞噬能力比未用AHL、ALL刺激的未成熟的BmDC细胞的吞噬能力更弱，进一步证明AHL、ALL能够刺激BmDC成熟。
二、对BmDC前体分化的影响
在无GM-CSF、IL-4的情况下，利用AHL/ALL诱导BmDC分化，FACS分析证实CDllc的表达量与阴性对照组有显著差异，即AHL/ALL不仅能够刺激BmDC成熟，还能在一定程度上诱导其分化。
三、对EL-4、JurkatT细胞增殖的影响
(1)JurkatT淋巴细胞经不同浓度AHL作用48h后，CCK-8法检测结果表明AHL能够显著抑制JurkatT淋巴细胞增长，且呈剂量-效应关系，镜下可见JurkatT淋巴细胞的集落形成受到抑制，随着AHL浓度增高，数量明显减少，细胞透光度降低。
小鼠T淋巴瘤细胞EL-4经不同浓度AHL、ALL作用48h后，CCK-8法检测结果表明桂木凝集素能够显著抑制小鼠T淋巴细胞瘤EL-4细胞的生长，且呈剂量-效应关系，镜下可见小鼠T淋巴瘤EL-4细胞随着桂木凝集素浓度增高，细胞数量明显减少，细胞大小不一，胞体皱缩，整体轮廓不清晰;AnnexinV/PI法应用FACS检测结果显示，AHL、ALL能够诱导EL-4细胞的凋亡。
四、对小鼠体内OVA特异性IgG的影响
AHL、ALL不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。根据以上桂木凝集素对DC及肿瘤细胞的影响，推测桂木凝集素可能是在细胞免疫方面产生抗肿瘤作用。
结论:
(1)AHL、ALL具有很好的促进BmDC成熟及增殖的作用，增殖率与浓度呈正相关。
(2)AHL、ALL能够一定程度地提高BmDC迁移能力。
(3)AHL、ALL-定程度上能够促进BmDC的分化。
(4)AHL能够明显抑制JurkatT淋巴细胞的生长。
(5)AHL、ALL能够明显抑制EL-4细胞的生长，并诱导其凋亡，其抗增殖作用可能是通过诱导细胞凋亡进行。
(6)AHL、ALL不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。
本课题组前期研究发现红桂木凝集素(ALL)能有效促进人外周血CD4+T淋巴细胞亚群的增殖，还能有效促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖。本实验首先将白桂木凝集素(AHL)、红桂木凝集素(ALL)作用于小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)，研究这两种凝集素对BmDC的分化、成熟、细胞因子释放、迁移、吞噬等方面的影响，探讨这两种凝集素对正常小鼠DC细胞的功能调控作用;其次将桂木凝集素作用于免疫系统的肿瘤细胞:人急性白血病T淋巴细胞(Jurkat T)、小鼠T淋巴瘤细胞(EL-4)，观察AHL、ALL对肿瘤细胞增殖的影响;再次为了探讨桂木凝集素在体内的免疫调控作用，将小鼠皮内免疫OVA/AHL/ALL，检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度，为本课题组今后的动物体内实验奠定基础。本研究进一步从分子水平探明AHL、ALL的免疫调控作用机制，并为其在临床疾病防治等方面的开发应用奠定良好的理论和实验基础。
方法:
一、对BmDC成熟的影响
无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以重组粒细跑-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)协同诱导下培养一段时间成为未成熟的树突状细胞后，加入不同浓度的AHL/ALL，作用48h后
1、倒置显微镜下观察细胞形态及数目的变化，应用CCK-8法检测细胞的增殖率;
2、应用荧光标记抗体结合荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cellsorting，FACS)检测BmDC表面协同刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达;
3、应用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测BmDC产生的细胞因子IL-12/P40和IFN-γ的水平;
4、以Transwell小室迁移实验分析BmDC迁移能力的变化;
5、以酵母菌的吞噬实验评估BmDC的抗原摄取能力。
二、对BmDC前体分化的影响
无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，在完全培养基中培养，同时添加不同浓度AHL/ALI。培养八天，以只有完全培养基培养的BmDC为阴性对照，阳性对照组的培养基为含有GM-CSF、IL-4而不含桂木凝集素的完全培养基
1、采用FACS分析细胞表面CD11c含量的变化;
2、应用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测树突状细胞产生的细胞因子IL-12/P40和JFN-γ的水乎。
三、对EL-4、JurkatT细胞增殖的影响
(1)本课题组前期已研究ALL对人急性淋巴细胞白血病JurkatT淋巴细胞增殖的影响，为了从多层面了解桂木凝集素的抗肿瘤作用，本实验将不同浓度AHL作用于JurkatT淋巴细胞，作用48h后，利用倒置显微镜及CCK-8法观察AHL对JurkatT淋巴细胞增殖的影响。
(2)常规培养小鼠T淋巴瘤细胞EL-4，将不同浓度桂木凝集素刺激EL-4细胞，作用48h后
1、利用倒置显微镜及CCK-8法观察AHL、ALL对小鼠T淋巴瘤细胞EL-4增殖的影响;@2、运用AnnexinV/PI双染法FACS检测，分析AHL、ALL对小鼠T淋巴瘤细胞EL-4凋亡的影响;
四、对小鼠体内OVA特异性IgG产生的影响
小鼠皮内注射OVA/AHL/ALL;两周后断尾取血，酶联免疫夹心法(ELISA)检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度。
结果:
一、对BmDC成熟的影响
CCK-8法结果显示AHL、ALL能显著促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)的增殖，且这两种桂木凝集素对BmDC的增殖作用具有剂量一效应关系。镜下可见BmDC数目明显增多，经不同浓度的桂木凝集素刺激后见较大体积的悬浮细胞，向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，低倍镜下可观察到随着AHL、ALL浓度的增加，细胞集落呈现更多更大的细胞团。说明AHL、ALL能够促进BmDC的增殖及集落的形成。
FACS分析证实AHL、ALL可促进BmDC表面协同刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅰ、Mmc-Ⅱ的表达，表明AHL、ALL可诱导BmDC的成熟。
ELISA检测培养细胞上清液中细胞因子IL-12/P40、IFN-γ的浓度，结果显示AHL、ALL能够促进这两种细胞因子的分泌，提示桂木凝集素可能诱导Th0细胞向Thl细胞分化，产生特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效应。
Transwell实验证实经AHL、ALL刺激成熟的BmDC迁移能力有所提高，但是与阴性对照组比较无显著性差异，p＞0.05。
酵母菌吞噬实验证明，经AHL、ALL刺激成熟的BmDC吞噬能力比未用AHL、ALL刺激的未成熟的BmDC细胞的吞噬能力更弱，进一步证明AHL、ALL能够刺激BmDC成熟。
二、对BmDC前体分化的影响
在无GM-CSF、IL-4的情况下，利用AHL/ALL诱导BmDC分化，FACS分析证实CDllc的表达量与阴性对照组有显著差异，即AHL/ALL不仅能够刺激BmDC成熟，还能在一定程度上诱导其分化。
三、对EL-4、JurkatT细胞增殖的影响
(1)JurkatT淋巴细胞经不同浓度AHL作用48h后，CCK-8法检测结果表明AHL能够显著抑制JurkatT淋巴细胞增长，且呈剂量-效应关系，镜下可见JurkatT淋巴细胞的集落形成受到抑制，随着AHL浓度增高，数量明显减少，细胞透光度降低。
小鼠T淋巴瘤细胞EL-4经不同浓度AHL、ALL作用48h后，CCK-8法检测结果表明桂木凝集素能够显著抑制小鼠T淋巴细胞瘤EL-4细胞的生长，且呈剂量-效应关系，镜下可见小鼠T淋巴瘤EL-4细胞随着桂木凝集素浓度增高，细胞数量明显减少，细胞大小不一，胞体皱缩，整体轮廓不清晰;AnnexinV/PI法应用FACS检测结果显示，AHL、ALL能够诱导EL-4细胞的凋亡。
四、对小鼠体内OVA特异性IgG的影响
AHL、ALL不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。根据以上桂木凝集素对DC及肿瘤细胞的影响，推测桂木凝集素可能是在细胞免疫方面产生抗肿瘤作用。
结论:
(1)AHL、ALL具有很好的促进BmDC成熟及增殖的作用，增殖率与浓度呈正相关。
(2)AHL、ALL能够一定程度地提高BmDC迁移能力。
(3)AHL、ALL-定程度上能够促进BmDC的分化。
(4)AHL能够明显抑制JurkatT淋巴细胞的生长。
(5)AHL、ALL能够明显抑制EL-4细胞的生长，并诱导其凋亡，其抗增殖作用可能是通过诱导细胞凋亡进行。
(6)AHL、ALL不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。