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本实验选取中国对虾新品种“黄海2号”为实验对象,以干热、60Coγ射线和双乙烯亚胺(binary ethyleneimine,BEI)灭活的白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)为媒介,诱导中国对虾产生免疫致敏(immune priming)反应;并分析比较不同诱导方式对二次感染WSSV后对虾死亡率、平均存活时间及相对免疫保护率的影响,并分析了可能与免疫致敏反应相关的FcDscam基因在组织和时空上的变化规律,以期探究中国对虾免疫致敏反应的发生机制,为对虾疾病的预防探寻新的方法。具体研究内容如下:本实验拟探究经热灭活的WSSV能否诱导中国对虾产生免疫致敏反应。实验将患有典型白斑综合征症状的对虾取腹部肌肉剁碎后经60℃灭活1 h,采用单尾定量口饲的方法,连续6 d投喂不同水温条件(15℃、23℃、28℃、32℃)下的实验组对虾(E15℃、E23℃、E28℃、E32℃);同时设置常温(23℃)条件下阳性对照组C23℃(投喂未经灭活的WSSV毒饵)、对照组CF23℃(只投喂商业配合饲料)。在实验第13d对存活个体进行第二次人工WSSV感染,结果显示,WSSV经60℃处理1 h可彻底失活,表现为连续投喂6天至第二次人工感染期间无对虾死亡,而阳性对照组C23℃死亡率为100%。截止实验第19 d,E15℃、E23℃、E28℃、E32℃各组存活率分别为80.41%、33.29%、8.47%、16.43%,CF23℃组的存活率为8.89%,E15℃组与其它各实验组差异极显著(P<0.01),E23℃与CF23℃、E28℃、E32℃组差异显著(P<0.05),E28℃和E32℃组差异不显著(P>0.05);对各组实验材料进行WSSV绝对荧光定量检测,结果显示,经热灭活WSSV诱导的中国对虾二次感染WSSV后,28℃环境下病毒的增殖速度最快,高温(32℃)和低温(15℃)都会不同程度抑制WSSV的增殖速率。实验证明,热灭活WSSV可以诱导中国对虾产生免疫致敏反应,对感染WSSV后的中国对虾具有一定的保护作用;温度与WSSV的增殖速率密切相关。通过同源克隆和RACE技术获得了中国对虾(F.chinensis)Dscam基因cDNA序列全长,并对该序列进行生物信息学分析。结果显示,中国对虾Dscam基因全长6624 bp,其中包括171 bp的5’端非编码区(5’UTR),459 bp的3’端非编码区(3’UTR);开放阅读框(ORF)的长度为5994 bp,共编码1997个氨基酸,命名为FcDscam。该基因编码的蛋白含有一个信号肽(signal peptide)、10个Ig(immunoglobulin,Ig)结构域,6个FNIII(fibronectin type III,FNIII)功能区,1个胞质尾区(cytoplasmic tail),1个跨膜结构域(transmembrane domain)。经同源比对和系统进化树分析,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)与中国对虾的相似性最高,为92.4%,在系统进化树中,先与凡纳滨对虾聚为一支,然后同其它几种甲壳动物红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)、通讯螯虾(Pacifastacus leniusculus)、普通滨蟹(Carcinus maenas)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)聚为一大支。连续投喂6 d热灭活WSSV饵料诱导免疫致敏反应,在0 d,6 d,12 d及二次感染后12 h,24 h,48h,72 h,168 h分别取样,用RT-PCR的方法检测FcDscam相对表达量。结果显示,FcDscam基因在第12 d开始上调,与对照组差异显著(P<0.05);二次感染后24 h,相对表达量达到最大值,与对照组差异极显著(P<0.01);48 h后基因表达量开始下降。实验表明,中国对虾存在Dscam基因,并在免疫致敏过程中发挥重要作用。为了探究如何有效的诱导对虾等无脊椎动物的免疫致敏反应,实验通过物理方法60Coγ辐照灭活患典型白斑综合征的对虾肌肉,连续10 d投喂灭活的WSSV饵料;使用化学试剂双乙烯亚胺灭活白斑综合征病毒悬液,在实验第1 d和6 d注射灭活的WSSV病毒悬液,10 d后将诱导存活的个体均分为注射感染组和口饲感染组,并分别设置阳性对照和阴性对照,分别进行二次感染。二次感染7 d,γ-射线诱导组相对免疫保护率为20.94%(口饲)和13.64%(注射);BEI灭活诱导组相对免疫保护率为45.23%(口饲)和11.11%(注射)。在免疫诱导阶段,0 d,3 d,6 d和10 d及二次感染后0 h(10 d),6 h,12 h,24 h,48 h取BEI灭活组样品,通过实时荧光定量PCR分析Dscam基因时空和组织表达特征。结果发现,BEI第一次注射诱导后3 d,血淋巴中Dscam基因相对表达量开始上调,在第10 d达到诱导阶段的最大值,与WSSV感染组和PBS组差异显著(P<0.05)。二次注射和饲喂感染后,血淋巴中Dscam基因的表达量一直维持在较高水平,显著高于对照组(P<0.05)。且两种感染方式下存活个体Dscam基因的相对表达量达到最大值。综上所述,γ-射线和BEI都可以有效的灭活WSSV,并且可以诱导免疫致敏反应的发生,且这种免疫保护对饲喂和注射感染都有效。Dscam可以被灭活的WSSV诱导上调,这说明Dscam可能与免疫致敏密切相关。