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青光眼是一种常见的致盲性眼病，其病理基础是视网膜神经节细胞(RGCs)及其神经纤维的丧失。多种因素与其发病有关，其中病理性高眼压可以造成视网膜的缺血低氧性损伤并导致RGCs最终主要以凋亡的形式丢失。RGCs凋亡在青光眼的病理损害中起重要作用，因此研究具有抗凋亡作用的RGCs保护药物，对青光眼的防治有重要意义。视网膜Müller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，不仅起着支持和营养神经元的作用，还有维持细胞外离子的稳定及参与谷氨酸盐循环、突触传递等作用。此外，Müller细胞参与RGCs的代谢、内环境稳态以及神经递质的运输、摄取，因此它在RGCs的生长、损伤、修复和再生中都起到重要的作用。最新研究发现，Müller细胞参与多种病理和生理过程，并且在视网膜的多种疾病中都发现Müller细胞的活化，即反应性胶质化(Reactivegliosis)。中间丝蛋白胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)高表达致胞体肥大是Müller细胞活化最主要的特征性改变。本实验利用前房灌注升高眼内压的方法建立急性高眼压(AOH)动物模型，探讨视网膜Müller细胞在急性高眼压大鼠视网膜中的活化情况，以及抑制其反应性胶质化对高眼压视网膜的影响，为青光眼患者神经保护的治疗提供实验依据。 实验在室温20-22℃下进行，选用成年雄性SD大鼠(8-10W,200-250g)，动物实验操作遵循美国视觉与眼科学研究会(ARVO)有关眼科和视觉科学实验动物使用规范，并得到首都医科大学动物管理委员会的许可。所用药物为胶质毒素α-氨基己二酸(AAA)，给药方式是玻璃体内注射5μl(50μg/μl)，其能选择性抑制Müller细胞反应性胶质化。实验动物分组如下:正常对照组(Ctrl)、急性高眼压(AOH，14.63kPa)1h后再灌注1、3和5d组、急性高眼压+给药(AOH+AAA)后再灌注1、3和5d组、单纯AAA给药及AOH+PBS对照组。造模后不同时间点，GFAP免疫荧光染色观察Müller细胞反应性胶质化程度，TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况，Thy-1染色标记视网膜RGCs细胞，蛋白免疫印迹(Westernblot)方法检测视网膜肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白表达水平。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni显著性检验进行统计学处理，数值以均数±标准误(X±SEM)表示，其中p＜0.05为差异显著。实验结果如下: 1.AOH对大鼠视网膜的影响 应用Hochest荧光染料标记视网膜内细胞核的结果表明，AOH(14.63kPa，1h)后再灌注1、3和5d组大鼠眼视网膜内丛状层(IPL)和内核层(INL)均显著变薄，且随再灌时间延长，损伤加重(P＜0.05，每组n=4)。同时，再灌注3和5d组神经节细胞层(GCL)和INL细胞排列紊乱，GCL细胞核数目明显减少。GFAP免疫组化检测结果示，正常大鼠视网膜内Müller细胞不表达或很少表达GFAP;AOH后再灌注1d，Müller细胞开始表达GFAP，再灌注3-5d后，视网膜内Müller细胞GFAP表达增加显著，甚至贯穿视网膜全层(P＜0.05，每组n=4)。结果提示，AOH确实引起视网膜损伤，并诱发Müller细胞反应性胶质化，即急性闭角型青光眼造模成功。 2.AAA对AOH鼠视网膜内Müller细胞反应性胶质化的影响 与AOH组相应再灌注时间点相比，应用玻璃体内注射AAA(5μl，50μg/μl)抑制Müller细胞反应性胶质化，即AOH+AAA组，可明显抑制视网膜Müller细胞内GFAP的表达(P＜0.05，每组n=4)，但对GFAP在星形胶质细胞的表达没有明显影响。此外，AOH+PBS组视网膜内GFAP的表达与高眼压组相近，排除了溶剂干扰。结果提示，AAA确实可以选择性抑制AOH鼠视网膜内Müller细胞反应性胶质化的发生。 3.AAA对AOH鼠视网膜损伤的影响 与Ctrl和单纯AAA组（未见凋亡细胞）相比，AOH可引起视网膜GCL层凋亡细胞(TUNEL阳性)显著增加，而AOH+AAA组凋亡细胞数明显减少(P＜0.05，每组n=4)。与Ctrl组相比，AOH引起视网膜内RGCs细胞(Thy-1阳性)大量丢失，而AOH+AAA组RGCs的丢失有所减轻(P＜0.05，每组n=4)。应用Hochest染色观察视网膜形态，AOH+AAA组缓解了AOH所引起的视网膜厚度变薄、细胞核排列紊乱及视网膜GCL层细胞数目的减少。结果提示，应用AAA抑制Müller细胞反应性胶质化的发生，可对AOH鼠视网膜起到保护作用。 4.抑制Müller细胞反应性胶质化对AOH鼠视网膜内TNF-α表达的影响 Westernblot结果表明，AOH处理后5d，视网膜内TNF-α蛋白的表达量明显高于Ctrl组，而AOH+AAA组视网膜内TNF-α蛋白表达水平较AOH组显著降低(P＜0.05，每组n=4)。同时，AOH+PBS组视网膜内TNF-α蛋白的表达水平与AOH组相近，即可排除溶剂干扰。结果提示，AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可能是通过降低视网膜内TNF-α蛋白的表达，来减少其对RGCs细胞的毒性作用，从而促进神经节细胞的存活。 综上所述，我们的研究结果表明，Müller细胞反应性胶质化参与了AOH所致视网膜损伤，应用AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可降低视网膜内TNF-α蛋白的表达水平，从而有效保护高眼压视网膜。所获成果丰富了人们对AOH致视网膜损伤的分子机制，同时为临床改善急性闭角型青光眼视网膜病变提供了一种有效治疗方法。