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[目的]优化从人胚胎胰腺组织分离纯化胰腺干细胞的方法，以最大限度地获取胰腺干细胞，并将胰腺干细胞在体外大量扩增后诱导分化为胰岛样细胞团，检测其胰岛素分泌功能，寻找能用于糖尿病的干细胞移植治疗的资源，为糖尿病细胞移植治疗的临床运用奠定基础。
[方法]无菌条件下取孕3-6月龄人工流产胚胎胰腺组织，剪碎后用不同浓度Ⅳ型胶原酶在相同条件下消化分离得到胰岛样细胞团(islet-like cellclusters，ICCs)，用差速贴壁法分别培养ICCs和其他细胞，根据不同细胞的贴壁时间不同将不同细胞分离，进一步培养后纯化，得到相对纯净的细胞成分，比较不同条件下的实验效果。并比较不同种类培养基和不同浓度血清对细胞贴壁效果的影响。
采用正交设计系统比较不同培养基、不同浓度血清和各种细胞因子组合(碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子)对胰腺干细胞增殖的影响，优化胰腺干细胞的扩增体系，筛选出本实验条件下的最佳培养体系，并以此系统对胰腺干细胞进行扩增，分析扩增后的细胞总数和胰腺干细胞标志分子ABCG2和nestin阳性细胞的扩增能力。
将经过扩增的胰腺干细胞用胰岛素分泌细胞(insulin-producingcells，IPCs)诱导培养基进行分化诱导，使胰腺干细胞向IPCs分化。当有胰岛样细胞团(ICCs)形成后，DTZ染色和胰岛素免疫组化鉴定。然后用葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)收集上清液，ELISA法检测IPCs的胰岛素分泌水平。
[结果]从孕3-6月胚胎胰腺组织分离胰腺干细胞，在相同分离条件下，以Ⅳ型胶原酶浓度为0.25mg/ml分离效果最好，0.5mg/ml和1mg/ml浓度效果不佳；在不同种类培养液和不同浓度的血清中，L-DMEM与15％小牛血清组合效果最佳，H-DMEM和RPMI1640与其他浓度血清的组合效果不好；ICCs在L-DMEM培养液中培养36小时贴壁，其它细胞贴壁较早，据此特性可以将ICCs与其他细胞分开并进一步得到纯化的胰岛干细胞(胰腺干细胞的主要成分)。
不同浓度血清、EGF、bFGF、HGF对人胚胎胰腺干细胞的增殖有不同影响，正交实验结果表明15％的血清，15 ng/ml EGF，5ng/ml HGF，15ng/ml bFGF最有利于胰腺干细胞的增殖。在最佳培养条件下，胰腺干细胞扩增良好：连续扩增15代后，细胞总数可达原来的1010倍；具有胰腺干细胞标志的ABCG2阳性细胞和nestin阳性细胞可达原来的1012倍，且ABCG2阳性细胞的扩增能力要优于nestin阳性细胞；免疫组化染色和流式细胞仪分析，结果显示人胚胎胰腺干细胞nestin和ABCG2抗原表达阳性，分别为(38.22±0.37)％和(53.33±7.02)％，且存在(37.3±0.79)％的nestin和ABCG2抗原共表达。
胰腺干细胞在诱导液1：无糖DMEM+15％NBS+10mmol/L，NIC+10ng/mlHGF+不同浓度的葡萄糖(0 mmol/L、2.8 mmol/L、5.6 mmol/L和11.2 mmol/L)和诱导培养液2：L-DMEM+15％血清+10mmol/L NIC+不同浓度的HGF(0ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)中连续诱导15天后，出现ICCs，且ICCs DTZ染色阳性，胰岛素免疫组化染色阳性。葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)发现，当诱导液中葡萄糖浓度为2.8mmol/l时，胰岛素分泌量最高为(48.97±1.80)μIU；当葡萄糖的浓度一定时，诱导液中HGF浓度为10ng/ml时胰岛素分泌量最高为(47.42±1.20)μIU。
[结论]
1.本实验优化了人胚胎胰腺干细胞的分离纯化方法。在相同分离条件下，以Ⅳ型胶原酶浓度为0.25mg/ml分离效果最好；根据ICCs与其它胰腺细胞贴壁时间不同，以36h为分界线，可以进一步得到纯化的胰岛干细胞；在不同种类培养液和不同浓度的血清中，L-DMEM与15％小牛血清组合效果最佳。
2.不同浓度血清、EGF、HGF和bFGF对人胚胎胰腺干细胞增殖有不同的影响。正交实验结果表明15％的血清，15 ng/ml EGF，5ng/ml HGF，15ng/ml bFGF最有利于胰腺干细胞的增殖。在此培养条件下，胰腺干细胞扩增能力最好。
3.其它条件一定的情况下，2.8mmol/l葡萄糖和10ng/mlHGF更有利于胰腺干细胞的诱导分化。