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目的：1、评价前列腺按摩后尿液中DD3mRNA和AMACRmRNA的联合定量检测在前列腺癌诊断中的价值.2、对DD3基因的生物学特性进行初步研究,为进一步研究其表达调控机制和生物学功能奠定基础.
方法：1、根据GenBank中的AMACRmRNA序列,在其外显子2和3之问设计一对引物和一条Taqman-MGB探针,优化反应体系,建立AMACRmRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ RT-PCR)检测方法,并对其进行方法学评价.DD3mRNA的FQ RT-PCR检测方法是本实验室已经建立的,该方法的检测灵敏度达6拷贝/反应,线性范围为6～6×10<8>拷贝/反应,Ct值与拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数达0.994,方法具有良好的重复性,批内、批间变异系数分别为1.25～2.06﹪和2.32～3.59﹪.2、本研究的临床病例包括前列腺癌(PCa)组21例,年龄58～85岁,平均72岁,经Jewett临床分期:B期7例,C期4例,D期10例;经Gleason病理分级:高分化癌3例,中分化癌11例,低分化癌7例;良性前列腺增生(BPH)组27例,年龄51～83岁,平均69岁.3、前列腺穿刺活检前,留取患者经前列腺按摩后的尿液,离心取沉渣,用FQRT-PCR方法分别检测其中DD3mRNA和AMACRmRNA的含量.由于尿沉渣中不仅含有PCa细胞和非恶性前列腺细胞,还含有膀胱上皮细胞、尿道上皮细胞等其它脱落细胞,故不能用管家基因GAPDH或β-actin来校正细胞数.PSAmRNA在正常前列腺细胞中表达相对恒定,在PCa细胞中的表达也仅有轻微下降(～1.5倍),而在其它脱落细胞中并不表达,所以用PSAmRNA来校正尿沉渣中的前列腺细胞数(PSAmRNA的FQ RT-PCR检测方法本实验室已经建立),且只有PSAmRNA检测呈阳性的尿液标本才被认为含有足够的前列腺细胞,方可进行DD3mRNA和AMACRmRNA的检测.尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的含量分别用比值DD3mRNA/PSAmRNA和AMACRmRNA/DD3mRNA表示.本研究对前列腺按摩后尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的联合定量检测在前列腺癌诊断的效能进行了分析评价.4、检测前列腺癌细胞株LNCap经无雄激素培养基培养后以及经含有不同浓度双氢睾酮的培养基培养后DD3mRNA的表达变化情况.
结果：1、成功建立了检测AMACRmRNA的FQ RT-PCR方法,该方法检测灵敏度达5拷贝/反应,线性范围为5～5×10<8>拷贝/反应,Ct值与拷贝数之间具有良好的线性关系,相关系数为0.998.批内、批间变异系数分别为1.68～2.30﹪和2.52～4.27﹪.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和测序分析证实为AMACRmRNA的特异性序列.2、PCa组尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的含量均明显高于BPH组,差异具有统计学意义(P<0.01).ROC曲线分析结果显示,DD3mRNA和AMACRmRNA的曲线下面积(AUC-ROC)分别为0.767(95﹪CI:0.635～0.900)和0.727(95﹪CI:0.582～0.871),两者的最佳截断值(cutoff)分别为0.067和0.214,此时DD3mRNA和AMACRmRNA诊断前列腺的灵敏度分别为76.19﹪和66.67﹪,特异度分别为70.37﹪和74.07﹪,阳性预测值均为66.67﹪,阴性预测值分别为79.17﹪和74.07﹪.若将DD3mRNA和AMACRmRNA对前列腺癌进行联合诊断,其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.48﹪、55.56﹪、61.29﹪和88.24﹪,其中灵敏度和阴性预测值均明显高于两者单独诊断时.如果血清PSA以4ng/ml为临界值,则血清PSA诊断前列腺癌的特异度只有14.8﹪,故尿液DD3mRNA和AMACRmRNA无论是单独诊断还是联合诊断前列腺癌,特异度均明显高于血清PSA.前列腺癌不同临床分期和病理分级之间尿液DD3mRNA和AMACRmRNA联合检测阳性率无显著性差异,但随着病理分级的增高有上升趋势.3、LNCap细胞经无雄激素培养基培养24h、48h及72h后,其DD3mRNA的表达量分别下降了63.14﹪、64.89﹪和81.57﹪,而在DHT浓度为0.05μg/L、0.5μg/L及5μg/L的培养基中培养48h后,DD3mRNA的表达量分别是无雄激素培养基培养细胞的1.94倍、5.07倍和7.11倍.
结论：1、尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的联合检测具有较高的灵敏度和阴性预测值,在PCa的筛查和早期诊断中具有较好的临床应用价值.
2、DD3基因的表达是受雄激素调节的,这一结果为今后进一步研究DD3基因的表达调控机制和生物学功能提供实验依据.