论文部分内容阅读
急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高，是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善，儿童急性白血病治疗得到了巨大进步，然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差，许多患者复发后治疗失败，最终死亡。目前，急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时，才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而，化疗副作用强，耐药易复发，经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题，且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。
多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道，结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法，提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中，沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍，且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实，是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。
本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞(Acute lymphoblastic leukemia， ALL)L1210、人源急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)细胞HL-60皮下移植瘤模型，和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型，评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果，并探究了其可能的作用机制，主要研究内容如下：
1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明，减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖，并诱导其凋亡。
2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明，VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTPNick-EndLabeling，TUNEL)免疫荧光结果表明VNP20009能显著诱导肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体，肿瘤组织大面积坏死。WesternBlot检测肿瘤组织蛋白表明，VNP20009能显著上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达，诱导急性白血病细胞凋亡。
3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明，VNP20009显著抑制小鼠体内AML细胞的增殖；降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值，使其恢复至近正常生理水平；延长了AML小鼠的生存期。
4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明，VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)的产生，并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)水平来抑制、杀伤肿瘤细胞；另一方面，显著上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10(C-X-C motif ligand-10，CXCL-10)和CC趋化因子配体-2(C-C motif ligand-2，CCL-2)，招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖，杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化，释放IFN-γ，进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。
结论：减毒沙门氏菌VNP20009能显著抑制白血病细胞的增殖，并促进其凋亡，起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后，能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖，增强机体抗肿瘤免疫力，抑制和杀伤白血病细胞，延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加，提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道，结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法，提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中，沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍，且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实，是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。
本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞(Acute lymphoblastic leukemia， ALL)L1210、人源急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)细胞HL-60皮下移植瘤模型，和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型，评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果，并探究了其可能的作用机制，主要研究内容如下：
1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明，减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖，并诱导其凋亡。
2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明，VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTPNick-EndLabeling，TUNEL)免疫荧光结果表明VNP20009能显著诱导肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体，肿瘤组织大面积坏死。WesternBlot检测肿瘤组织蛋白表明，VNP20009能显著上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达，诱导急性白血病细胞凋亡。
3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明，VNP20009显著抑制小鼠体内AML细胞的增殖；降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值，使其恢复至近正常生理水平；延长了AML小鼠的生存期。
4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明，VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)的产生，并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)水平来抑制、杀伤肿瘤细胞；另一方面，显著上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10(C-X-C motif ligand-10，CXCL-10)和CC趋化因子配体-2(C-C motif ligand-2，CCL-2)，招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖，杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化，释放IFN-γ，进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。
结论：减毒沙门氏菌VNP20009能显著抑制白血病细胞的增殖，并促进其凋亡，起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后，能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖，增强机体抗肿瘤免疫力，抑制和杀伤白血病细胞，延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加，提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。