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根据NCBI同源比对,发现BmNPV ORF4(Bm4)与AcMNPV ORF11同源性最高,达96%,两者长度皆为1020 bp。在29种已测序的杆状病毒中,还有另外三种杆状病毒中有Bm4的同系物,这三种病毒分别是Plutella xylostella multiple nucleopolyhedrovirus,Rachiplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus和Maruca vitrata MNPV。在Bm4的启动子区有早期启动子基序。然而,目前Bm4的功能完全未知。
为了研究Bm4基因产物在病毒感染环境下在细胞中的定位,我们用融合到Bm4 3,端的EGFP作为报告基因,以BmNPV杆粒作为载体来表达Bm4-EGFP。用共聚焦扫描显微镜观察发现:荧光信号主要集中在细胞核内,然而在细胞膜上也有较弱的信号。
通过用SnaBI和BamHI酶切pFastBac1,切除多角体启动子,置换上iel启动子和Bm4启动子,我们成功构建了在iel启动子和Bm4启动子驱动下表达外源基因的重组病毒,为构建Bm4缺失病毒的拯救病毒奠定了基础。同时,用我们构建的pFastbac-4p-EGFP(EGFP在Bm4启动子驱动下的重组转座载体)转染家蚕细胞发现:在没有病毒因子作用下,EGFP在Bm4启动子的驱动下就能表达,说明Bm4是一个立即早期基因。
为了缺失Bm4,构建了Bm4转移载体,并将其与BmNPV杆粒共转染家蚕细胞。所得病毒连续感染家蚕3遍,之后,纯化病毒一次。然后提取病毒DNA,并将其转化进感受态DH10B细菌。然后将感受态DH10B细菌涂到含有卡那抗生素、X-gal和IPTG的平板上。挑取蓝色菌落,用Bm4引物做PCR鉴定。鉴定出一个含有Bm4缺失的杆粒的菌落。提取Bm4缺失的杆粒,并将其转染进家蚕细胞,转染后5天,发现细胞有感染症状。收集上清再感染另一瓶细胞,发现有感染症状,说明Bm4在家蚕细胞中不是病毒繁殖的必需基因。
为了排出第二位点突变的可能,我们利用Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统,以及多角体启动子被iel启动子和Bm4启动子替换的重组转座载体,构建了在Bm4缺失杆粒的多角体基因座位表达Bm4的拯救病毒。为研究Bm4基因产物的具体功能奠定了基础。
总之,根据我们的实验结果,可知Bm4是一个其蛋白产物主要定位于核内的立即早期、非必需基因。