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葡萄糖氧化酶以分子氧作为电子受体，氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，有效去除氧和葡萄糖，且生成的过氧化氢可有效抑菌杀菌，因此在食品、饲料等行业有广泛的应用。同时，因其对β-D-葡萄糖有高度特异性，在医药、生物等行业中也可应用于医疗诊断及生物监测。工业生产葡萄糖氧化酶的菌株主要来源于黑曲霉和青霉，产量、产品纯度较低，成本较高，通过构建基因工程菌来提高其产量成为目前最主要的手段。里氏木霉是FDA认证的安全生产菌株，具有非常强的蛋白分泌能力及类似高等动物的蛋白修饰系统，已成为表达真核来源基因的优良宿主。经过数年来的发展，作为基因工程宿主菌的里氏木霉常被用于异源蛋白的表达生产。但是，由于这些异源蛋白的表达水平常常远低于内源蛋白的表达，所以较难应用于工业化生产。本研究在里氏木霉中表达了密码子优化后的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因，并以此为模型探究了通过工程改造丝状真菌蛋白分泌途径来提高异源蛋白的表达。 主要研究结果如下: 1.优化的黑曲霉葡萄糖氧化酶的表达:根据里氏木霉密码子的偏好性对上述序列进行了优化，利用DNA Assembler技术构建pCbh1-god表达载体，结果表明优化后的基因在里氏木霉中TU-6和Tu-6△tku70成功表达，并筛选得到Tu-6△tku70-2号转化子酶活最高，在诱导培养基中发酵92 h时酶活最强，达到4.63 U/mL。相对出发菌株Tu-6△tku70的β-葡萄糖苷酶酶活0.66 U/mL，2号转化子的酶活提高到1.65 U/mL，提高了1.5倍;2号转化子的滤纸酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/mL和0.84U/mL，相对出发菌株的6.79 U/mL和0.57 U/mL也略有提高;内切纤维素酶活为2.58U/mL，相对出发菌株的3.19 U/mL则略有降低。 2.通过过表达Trichoderma reesei来源囊泡融合蛋白snc1基因、未折叠蛋白响应机制-激活因子hac1基因以及ER-分子伴侣bip1基因等蛋白分泌相关的组分基因，探究了这些组分基因对异源蛋白GOD分泌表达的影响。利用重组DNA Assembler技术将sncl基因连接到构建的pRS424-pdc1载体上得到snc1表达载体pPdc1-snc1;利用相同方法将bip1基因和去内含子的hac1基因和构建到pRS424-eno1载体上得到pEno1-bip1和pEno1-hac1表达载体。结果显示，过表达snc1基因能够有效提高GOD在T.reessei中的分泌表达。TGsnc菌株过表达囊泡相关蛋白snc1基因后，酶活比TG菌株提高了121％，由原来的GOD酶活0.28 U/mL(TG)提高到0.61 U/mL(TGsnc)。尽管GOD的分泌增强，过度表达的snc1并未导致总蛋白浓度的增加，表明当snc1过表达时对内生的分泌纤维素酶可能有负面影响。此外，TGsnc的总纤维素酶活(FPase)，内切葡聚糖酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶(BG)的酶活均低于相比TG。这些都表明过表达snc1对内源和外源蛋白分泌存在不同的影响。大量的GOD分泌时，其纤维素酶活下降;说明操纵一个蛋白分泌途径的组件基因的表达可能影响其他基因的表达。通过对高酶活的转子TGsnc和TGhac、TGbip转化子相应基因的转录水平变化分析:发现TGsnc转化子的snc1转录丰度是TG菌株的6.88倍，而分泌相关的bip1和hac1则相应地是TG的1.47和3.25倍。TGhac转化子相对于出发菌株TG而言，其hac1转录丰度上调5.61倍，而且蛋白分泌通路路径上的snc1和bip1的转录丰度上调3.81倍和4.85倍。TGbip转化子的过表达基因bip1的转录丰度是出发株的1.66倍，hac1无明显变化，而snc1表达却上调4.88倍。