【摘 要】
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弹性蛋白酶(elastase)是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛存在于哺乳动物及人的各种组织和体液中。弹性蛋白酶不仅能水解弹性蛋白，而且也可以水解其他蛋自
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弹性蛋白酶(elastase)是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛存在于哺乳动物及人的各种组织和体液中。弹性蛋白酶不仅能水解弹性蛋白，而且也可以水解其他蛋自质，如明胶、血红蛋白、自蛋白、血纤维蛋白等。因此广泛应用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理等行业，具有极大的经济价值和应用前景。目前国内主要从猪胰脏中提取，由于酶源受到限制，作为治疗用生化药物和其它方面的应用长期供不应求。
本研究以一产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，经PCR扩增得到1.5kb的弹性蛋白酶基因，测序后与GeneBank中的铜绿假单胞菌序列比对发现同源性100﹪。然后对PCR产物进行T-A克隆，获得质粒pMD18-Ela。将弹性蛋白酶基因切下，转入到载体pET28-a的6×His标签序列下游的多克隆位点获得中间载体pET28a-Ela。连同6×His序列一起将弹性蛋白酶基因克隆到杆状病毒表达载体系统的pBacPAK8转移载体，构建了重组载体pBacPAK8-His-Ela。同时，将绿色荧光蛋白基因直接克隆到pBacPAK8构建一对照载体pBacPAK8-GFP。用BamHⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ对pBacPAK8-His-Ela进行双酶切和单酶切验证，发现弹性蛋白酶及上游6×His序列正确插入到杆状病毒多角体启动子下。
采用脂质体介导法，将两个转移载体和亲本病毒一起共转染昆虫细胞系sf21，72小时后在荧光显微镜下观察到对照实验组的细胞发绿色荧光，供试样品组的细胞也发生了明显的NPV感染症状和病变。回收细胞培养上清，空斑纯化获得了重组病毒BacPAK-Ela及BacPAK-GFP。以扩大培养后的重组病毒BacPAK-Ela感染sf21细胞，96小时后分离培养基和细胞层进行以下试验：提取感毒细胞DNA作为模板，对弹性蛋白酶基因cDNA进行PCR扩增，能够得到1.5kb条带；提取感毒细胞总蛋白进行SDS-PAGE实验，可以发现与弹性蛋白酶(33KDa)大小相近的34KDa条带。以弹性蛋白为底物的平板水解实验，发现感毒细胞裂解液能够水解其专一底物弹性蛋白，证实了外源基因产物具有一定的生物活性。以地衣红-弹性蛋白为底物，通过和攻毒后不同时间的细胞裂解液进行水解反应测定酶活，得到了表达产物的最大酶活力为21u/ml。
通过对表达产物的酶学特性分析发现，外源弹性蛋白酶的最适作用pH值为9.5，在7.0-8.5的范围内稳定，最适作用温度为37℃，温度高于37℃时，酶活急剧下降，当温度达到50℃以上，酶几乎完全失活。弹性蛋白酶耐热性实验发现，在37℃下，酶的活力保持不变，当温度高于37℃，酶活力开始有较小损失，当温度高于50℃，酶活急剧下降，当温度达到60℃以上，酶活性几乎完全丧失。
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