【摘 要】
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目的:观察RNA干扰技术在抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制与表达方面的作用,同时,对Dicer基因在RNA干扰产生机制中的作用进行探讨。方法:(1)将1.3倍HBV基因克隆入pCDNA3.1中,构建HB
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目的:观察RNA干扰技术在抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制与表达方面的作用,同时,对Dicer基因在RNA干扰产生机制中的作用进行探讨。方法:(1)将1.3倍HBV基因克隆入pCDNA3.1中,构建HBV真核表达载体pHBV,将其转染肝癌细胞HepG2,建立HBV瞬时表达模型,并通过ELISA、免疫荧光、Southern和Northern blot检测对该模型进行评价;(2)针对乙型肝炎病毒的四个开发放性读码框,设计并构建十种shRNA表达载体pShRNA;将pHBV和pShRNA共转染入肝癌细胞,通过ELISA、免疫荧光、Southern、Northern、Western blot和RT-PCR检测,观察HBV复制与表达受抑制的情况。(3)设计并构建两种针对Dicer基因中RNA酶Ⅲ结构域的shRNA表达载体,即pShRNA-D1和pShRNA-D2,先将其转染HepG2 2.2.15细胞和结肠癌细胞,通过RT-PCR检测,观察Dicer基因受抑的情况。将pShRNA-D1转染整合了绿色荧光蛋白(GFP)基因的HepG2 A9细胞,以抑制其Dicer基因的表达,再转染抗GFP的shRNA表达载体,观察Dicer受抑制后,是否影响后续shRNA表达载体的功能发挥,以此反映Dicer酶在RNA干扰产生机制中的作用。
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